[일반생물학실험]단백질과 탄수화물의 검출 1부

실험 목적

생명현상과 생물체를 이루는 중요한 구성요소 중 하나인 단백질과 탄수화물을 발색반응을 이용하여 화학적으로 검출하여 본다.

 

실험 이론 및 원리

1. 단백질

1) 단백질

① C, H, O, N, S를 주성분으로 구성된 화합물로 20가지의 아미노산으로 조립된 중합체

② 아미노산이 펩타이드(=펩티드) 결합으로 연결된 고분자 화합물

2) 단백질의 구조

① 단백질은 복잡한 모양으로 접힌 긴 아미노산 사슬로 이루어짐

- 1개의 아미노기(-NH2), 1개의 카르복실기(-COOH), 1개의 수소원자를 가짐

- 모두 중심부의 탄소원자에 결함되어 있음

- 비극성 아미노산들은 안쪽에서 서로 뭉쳐있고 전하를 띄는 극성 아미노산들은 단백질의 표면부위에 위치

② 단백질 구조화의 4가지 단계

1차 구조		- 아미노산 서열
2차 구조		- 골격에 포함된 수소결합 형성 → α나선 : 폴리펩티드 사슬이 일정한 모양의 나선형코일을 형성하는 영역 → β병풍 : 다른 폴리펩티드 사슬 사이나 구부러진 폴리펩티드 사슬 내의 서로 다른 부분들 사이에서 일어남
3차 구조		- 곁사슬들 사이의 상호작용에 의존
4차 구조		- 폴리펩티드들 사이의 상호작용의 결과로 이루어짐

2. 단백질 검출

1) 밀롱 반응(Millon's reaction)

시료에 단백질이 들어있는 경우 백색 침전이 생기고, 60-70℃로 가열하면 적갈색(자색)으로 변한다. 이 반응은 아미노산인 티로신, 디옥시페닐알라닌 등의 하이드록시페닐기(-C6H4OH)의 존재에 의한 것으로 페놀 고리가 수은화합물을 형성하고 아질산에 의하여 질소화되어 강하게 착색된 수은 착염 된다. 따라서 단백질이 아닌 페놀이나 살리실산에도 발색한다.

2) 크산토프로테인 반응(Xanthoprotein reaction)

① 벤젠고리의 니트로화 반응(-NO2)을 이용한다.

② 방향족 아미노산 등을 가진 단백질들은 진한 질산에 의해 니트로화합물을 형성하면서 황색으로 변한다. 이러한 니트로화합물의 알칼리 금속염은 짙은 주황색을 나타낸다.

③ 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 등의 벤젠고리를 가진 아미노산에 반응한다.

3) 뷰렛 반응(Biuret reaction)

뷰렛반응 시약 속에는 2가의 구리이온(Cu2+)이 들어 있기 때문에 푸른색을 띤다. 시약이 단백질과 만나면 보라색으로 색이 변하는 성질을 이용한다. 색이 변하는 이유는 펩타이드 결합이 두 개 이상 존재하는 구조를 뷰렛이라 하는데, 이 뷰렛구조가 2가의 구리 이온()과 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하기 때문이다.

4) 닌히드린 반응(Ninhydrin reaction)

α-amino산, 펩티드 및 단백질은 pH 4-8에서 Ninhydrin과 함께 100℃로 가열할 때 착색물이 생성된다. Ninhydrin은 아미노산의 1차 아민그룹과 반응하여 청자색을 나타내어 아미노산의 발색시약으로 사용되어진다.

2차 아민그룹을 가지는 프롤린의 경우 청자색이 아닌 주홍색을 나타낸다. 이 반응은 매우 예민하여 amino acid 및 단백질의 확인반응으로 널리 사용되고 아미노산의 정량에도 이용되고 있다. 단백질의 분자량이 크면 클수록 반응이 빨라진다.

 

3. 탄수화물

1) 탄수화물

C, H, O로 이루어져 있는 유기 화합물. 식물체의 광합성에 의해 만들어진다. 생명체를 구성하고 생물이 살아가는데 필요한 에너지를 생성하는 기본물질이다. 분자 내 알데히드와 케톤기를 가진다. 당류라고도 하며 녹말, 셀룰로오스, 글루코오스와 같이 일반식을 C2(H2O)m로 나타낼 수 있는 물질

① 단당류

- 가장 간단한 탄수화물

- 3탄당 : 젖산, 피부르산(C3H6O3)

- 5탄당 : 리보오스(RNA, ATP의 성분), 데옥시리보오스(DNA의 성분), 리블로오스(RuBP의 성분)

- 6탄당 : 포도당, 과당, 갈락토오스, 만노오스

포도당	과당	갈락토오스

② 이당류

- 단당류 2개가 글리코시드 결합으로 이루어짐

- 맥아당(포도당 + 포도당)

- 설탕(포도당 + 과당)

- 젖당(포도당 + 갈락토오스)

③ 다당류

- 여러 개의 단당류 축합하면서 결합한 것

- 글리코겐, 셀룰로오스, 녹말(포도당 + 포도당 +…), 이눌린(과당 + 과당 +…)

 

4. 탄수화물 검출

1) Benedict's Test

① 환원성을 가진 탄수화물에만 선택적으로 작용한다.

 CuSO4 + 2OH- → Cu(OH)2 + 당 → Cu2O↓ + H2O + 산화된 환원당

② 한가지 시약용액을 쓰기 때문에 편리하며 알칼리성이 훨씬 약하므로 더 안정하다.

③ 환원당의 알칼리용액에서 Cu염을 환원시켜 적갈색의 Cu2O를 형성한다.

2) Fehling's Test

① 환원성 탄수화물을 확인하는 고전적인 방법이다.

2Cu(OH)2 → Cu2O↓ + H2O + [O]

② CuSO4는 알칼리와 반응하여 Cu(OH)2가 되고 이것이 환원성을 가진 탄수화물에 의해 환원되어 적갈색의 Cu2O로 변한다.

③ 알코올 -OH기를 가진 유기화합물은 2개의 구리 화합물과 더불어 용해성 착화합물을 만든다. 이것을 쓰면 Cu(OH)2의 용해도가 커지고 시약의 안정성도 커진다.

3) Iodine Test

녹말의 검출을 확인할 때 사용한다. 요오드 분자(I2)는 무극성 분자로서 극성 용매인 물에 잘 녹지 않는다. 그러나 물에 요오드화칼륨(KI)을 녹여 만든 요오드화칼륨 수용액에는 잘 녹는다. 따라서 요오드를 요오드화칼륨 수용액에 녹여 만든 요오드-오요드화칼륨(I2KI)용액을 사용한다. 요오드-오요드화칼륨 수용액(황갈색)을 녹말에 떨어뜨리면 녹말 분자 속으로 요오드 원자단이 끼어 들어가게 되고 갈색을 띄고 있는 요오드-오요드화칼륨 수용액의 색깔이 청남색으로 변한다.

실험 기구 및 시약

1. 단백질 검출

1) 기구 : 유리시험관, 500㎖ beaker, pipette, 스포이드, Vortexer, heating stirrer

2) 시약 : HNO3(질산), 10% NaOH(수산화나트륨)용액, 0.5% CuSO4(황산동)용액, 0.1% Ninhydrin 용액

3) 재료 : 알부민, 젤라틴, 증류수, 설탕, 우유

2. 탄수화물 검출

1) 기구 : Test tube, 500㎖ beaker, pipette, 스포이드, Vortexer, heating stirrer

2) 시약 : Benedict's solution, Fehling's solution, SudanⅢ solution, Iodine solution(I2KI)

3) 재료 : 1% Sucrose(설탕), 1% Glucose(포도당), 1% Starch(전분), dH2O(증류수), 음료수

[Biology/일반생물학] - [일반생물학실험]단백질과 탄수화물의 검출 2부