[일반화학실험]산화-환원 적정 : 비타민 C의 정량 1부

실험 목적

1. 산화제나 환원제는 같은 당량끼리 반응이 완결되므로 산화-환원 반응을 이용하여 산화제나 환원제의 양을 결정할 수 있다. 

2. 산화-환원 적정을 통하여 비타민 C를 정량함으로써 산화-환원 반응의 원리와 응용을 이해한다.

실험 이론 및 원리

1. 실험 배경

인간 문명의 발달은 산화․환원 반응과 함께 시작하고 발달 해 왔다고 해도 과언이 아니다. 부싯돌을 이용해 불을 지피던 원시인들은 연소라는 산화반응을 현상적으로 받아들였고, 청동 기 시대의 구리와 철기시대의 철을 제련하는 환원기술은 과학 발달사에 하나의 획을 그었다고 할 수 있다. 요리를 하기 위해 가스레인지의 불을 켜는 것, 상처 난 곳에 과산화수소로 소독을 하는 것, 거리를 걸으며 노래를 듣기 위해 사용하는 휴대용 음 향기기의 화학 전지, 노화 방지를 위해 복용하는 건강식품 등 현대 생활의 대부분이 산화․환원반응과 밀접한 관련을 가지고 있다.

 

산화-환원(oxidation-reduction or redox)반응은 전자 이동 반응이다. 화석 연료의 연소로부터 가정용 표백제 까지 산화-환원 반응은 우리의 일상생활과 밀접한 관련이 있다. 산화 반응은 전자의 손실이 수반되는 반쪽 반응이다. 화학자들은 원래 ‘산화‘를 특정 원소가 산소와 결합하는 의미로 사용했으나 지금은 산소가 관여하지 않는 반응도 포함하는 넓은 의미를 가지고 있다. 전자를 얻는 환원 반응도 반쪽 반응이다.

 

산화제는 다른 물질에서 전자를 빼앗아 자신은 환원되고, 환원제는 다른 물질에 전자를 주면서 자신은 산화되는 물질이다. 산화-환원 적정은 이러한 산화제 또는 환원제의 표준용액을 사용하여 시료 물질을 완전히 이러한 산화제 또는 환원제의 표준용액을 사용하여 시료 물질을 완전히 산화제 또는 환원제의 표준용액을 사용하여 시료 물질을 정량하는 부피분석법이다. 산화-환원 적정에 이용할 수 있는 산화제 표준물질은 여러 가지가 있으나 일반적으로 아이오딘산 칼륨과 과망간산칼슘이 널리 쓰인다.

 

비타민C는 거의 모든 음식물에 들어있을 정도로 아주 쉽게 접할 수 있는 비타민의 일종이다. 거의 모든 포유류는 비타민 C를 자체적으로 합성 할 수 있다. 인간 역시 인류초기에는 이를 합성할 수 있었지만 언젠가 부터인지 기능이 사라져 여러 관련된 질병들이 발생하고 있다. 비타민 C의 항산화 기능은 노화를 예방할 수 있다고 하며, 인체에서 이 비타민이 결핍되면 괴혈병이 발생한다. 괴혈병을 방지한다는 의미에서 이 물질이 아스코브르산(ascorbic acid)으로 명명되었는데 나중에 비타민 C로 더 잘 알려지게 되었다.

그림  1. Ascorbic Acid

또한, 비타민 C는 신경 보호 효과를 지니는 것으로 밝혀졌다. 중간정도의 비타민 C와 DHA의 복용은 의미있는 수준으로 세포사를 막았다. 비타민 C의 화학적 성질을 살펴보면 L-ascorbic Acid(AA)는 dehydro-L-ascorbic acid(DA)로 쉽게 산화된다. 또 dehydro-L-ascorbic acid로 2,3-diketo-L-gluonic acid(DG)로 산화된다. AA와 DA 사이의 변환은 가역적 산화·환원 변환이지만 DA가 DG로 산회되는 것은 비가역적 반응이다. 즉 비타민 C인 AA는 DA로 산화되면서 환원제로서 작용할 수 있는 물질이다.

그림 2. Ascorbic Acid(AA) to 2,3 Diketo-L-gluonic Acid(DA)

 

비타민 C는 동물의 콜라겐(collagen)을 합성하는데 필수적인 요소인데, 콜라겐은 혈액 응고에 관여하는 물질이다. 비타민 C가 부족하면 콜라겐 합성 과정이 차단되어 괴혈병의 전형적 증상인 출혈, 감염, 뼈의 연화 등의 증상이 나타난다. 콜라겐을 합성하는 효소는 Fe2+이온과 느슨하게 결합하고 있어야 활성형 효소로 작용하며, 산화되어 Fe3+로 변하면 활성이 없어진다. 

Ascorbic acid는 Fe3+이온을 Fe2+로 환원시키며 효소의 성분이 -SH기를 환원 상태로 유지시키는 기능이 있기 때문에 콜라겐 합성을 도와주는 조효소 구실을 한다. 이와 같이 비타민 C가 강력한 환원력을 지닌 물질이기 때문에 콜라겐 합성을 도울 수 있으며, 이 외에도 산화-환원 반응이 개입된 중요한 생명 현상이 있기 때문에 비타민 C가 필요할 것으로 예상된다.

 

콜라겐 새압성에 필요한 비타민 C의 농도를 검토하여 3T6 섬유아세포 및 초대연골 세포를 배양 하였을 때, 양 세포 모두 콜라겐 양은 비타민 C를 첨가한 세포가 높은 수치를 나타냈다. 이에 따라 비타민 C에 의한 콜라겐 합성의 촉진효과가 현저하였으며, 일수의 증가에 따라 그 합성량도 증가하였다.

 

하나의 아이오딘산(IO3)은 다음과 같이 반응하여 세 개의 아이오딘 분자(I2)를 생성한다.

IO3-(aq) + 5I-(aq) + 6H+(aq) → 3I2(s) + 3H2O(L)

또한 생성한 아이오딘 한 분자가 ascorbic acid 한 분자를 dehydroascorbic acid로 산화시킨다.

ascorbic acid + I2 → dehydroascorbic acid + 2H2 + 2I-

따라서 하나의 아이오딘산 이온은 세 분자의 ascorbic acid를 산화시킨다.

 

콜라겐은 비타민 C, oxygen, Fe2+, α-ketoglutarate, silicon이 조효소로 작용하여 proline과 lysine이 각각 hydroxylase의 작용으로 전구콜라겐 (procollagen)으로 합성된다. Hydroxylase는 2가 상태의 철분과 느슨하게 결합함으로 써 활성화되고, 3가의 철분으로 산화가 되면 효소의 활성을 잃는다. 이 과정에서 비타민 C는 산화된 철분을 다시 환원 시켜 효소를 활성화 시키며, silicon은 이들 hydroxylase 최 대 활성 유지를 위해 필요하다. 

Hydroxyproline은 콜라겐의 triple helix 구조에 많은 부분을 차지하며 그 구조를 안정화시키고, hydroxylysine은 hydroxyproline에 비해 양적으로 적으나 콜라겐 특유의 아미노산으로 콜라겐 합성 의 최종단계인 cross-linking의 형성에 중요한 역할을 한 다. 이와 같이 콜라겐의 posttranslational modification 과정은 비타민 C, silicon, 철분 등의 영양소와 주요 구성 아미노산인 proline과 lysine이 함께 사용된다.

그림 3. 비타민 C에 의한 일수별 콜라겐 합성량 증가

그림 4. 콜라겐 합성 과정

 

다른 정량법으론 테트라하이드로퓨란에 의한 추출방법을 이용해 츄잉검의 비타민 C를 정량 할 수 있다.

 

2. 효소법에 의한 표준곡선 비교

Tetrazolium 염인 MTT[3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide]는 PMS(5-methylphena-zinium methosulfonate)존재 하에서 모든 환원제에 의해 환원되어 formazan을 형성한다. 비타민 C는 AAO(Ascorbic acid oxidase)에 의해 특이적으로 환원되며, 환원된 비타민 C는 MTT와 반응하지 못하므로, AAO를 첨가한 것과 그렇지 않은 것 간에 MTT-formazan에 의하여 흡광도 차이가 발생되고 이는 비타민 C 농도와 비례하는 원리를 이용하여 정량할 수 있다.

Ascorbate + MTT + PMS → dehydroascorbate + MTT-formazan

Ascorbate + 1/2O2 + AAO → dehydroascorbate + H2O

그림 5. 표준곡선

3. THF와 효소법에 의한 껌의 비타민 C 정량

껌에 함유된 비타민 C를 정량하기 위해 우선 껌을 THF에 분산시켰다. 이것을 직접 효소반응에 적용하면 껌 분산액에 의해 흡광도 오류가 발생할 수 있으므로, 이를 보정하기 위해서 비타민 C를 포함하지 않은 껌을 THF에 분산시킨 후, 정확한 량의 비타민 C를 첨가한 분산액을 표준액으로 하였다.

또한, 비타민 C를 선형 중회기 분석법으로 정량할 수도 있다. 미분 스펙트럼에서 관찰되는 각 성분들의 특이 peak들을 종합하여 이들과 각 성분의 농도 간에 선형 중회기 분석(multiple linear regression)을 실시했다. 이를 위하여 미분 스펙트럼에서 특정 peak의 미분값들을 추출해내는 컴퓨터 프로그램(Language : APPLESOFT BASIC) 및 이로부터 얻어진 데이터를 이용하여 선형 중회기 분석 및 변수의 선택을 실시하는(stepwise regression) 프로그램 및 이 분석 결과로부터 얻어지는 회귀방적식을 이용하여 실제 시료중의 각 성분의 농도를 계산하는 프로그램을 작성하였다. 정량대상이 된 비타민들은 pH2.1 염산 완충액에서 녹여 스펙트럼 acquisition을 실시했다.

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