[일반생물학실험]브로콜리 DNA 추출 및 전기영동 관찰

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

브로콜리로부터 DNA를 추출하고 전기영동을 통해 DNA를 직접 관찰하는 실험을 진행했다. 브로콜리를 갈아 여러 차례를 거쳐 브로콜리로부터 DNA를 추출하고, 직접 agarose gel을 만드는 시간을 가졌다. DNA를 추출하는 것을 마치고 전기영동으로 DNA를 관찰하였다.

 

2. 실험 배경

DNA를 추출하기 위해 브로콜리를 갈아주는데 이는 물리적 힘을 적용해 세포벽을 깨기위함이다. 세포벽을 깨서 세포질, 핵이 드러나도록 하기 위해 브로콜리를 갈아준다. 그리고 세제를 넣어주는 이유는 세제가 계면 활성제 역할을 하기 때문이다. 계면활성제란 세포막, 핵막을 깨뜨리는 것을 도와준다. 세포막의 인지질을 흐트려 놓는 역할이라고 할 수 있다. 또한 NaCl을 넣어주는데 이는 DNA가 감고 있는 히스톤 단백질을 제거해 순수한 DNA를 추출하는 역할과 DNA를 응집시키는 역할을 한다.

이렇게 섞어준 용액을 실온에 30분 방치할 때 전기영동을 위해 Agarose gel을 만든다. Agarose gel 전기영동은 gel의 well에 물질을 넣고 완충용액으로 TAE buffer을 붓고 전압을 걸어주는 방식이다. Gel을 통과할 때 입자의 이동거리는 전하에 비례, 입자 크기에 반비례, 입자 질량에 반비례, 저항에 반비례한다. 즉, 입자간의 이동거리를 비교함으로써 시료를 분류할 수 있는 것이다. 또한 비교가 쉽게 하기 위해 Marker를 gel에 같이 전기영동하여 시료 물질을 추측하는 데 용이하게 한다.

Agarose gel을 만들 때 함께 넣어주는 용액 TEA buffer은 전하를 띈 입자를 운반해 줄 이온을 가진 완충용액이다. TEA buffer 용액은 정확히 T는 Tris base를 뜻하며 양이온을 공급하는 역할을 하는데 이때 pH가 11로 DNA를 해리시킬 정도로 높다. 그래서 A, acetic acid가 pH를 낮춰주는 역할을 한다. 마지막으로 E, EDTA는 DNA가 Dnase라는 효소에 의해 분해되는 걸 막는 역할을 한다.

이 실험에서 에탄올도 중요한 역할을 한다. 에탄올이 차가울수록 DNA 분해가 더 잘된다고 했는데 이는 시원한 에탄올일수록 용액 속에 녹아있는 DNA를 불용성으로 만들어 떠오르게 하기 때문이다. 이번 실험에서 가장 흥미를 끌만한 용액은 EtBr (Ethidium Bromide)이다. EtBr은 염기 사이사이에 스며들어가는 강력한 발암물질이며 독성을 지니므로 반드시 조심스럽게 다루어야 한다. 이렇게 위험한 용액이지만 DNA를 최종적으로 확인하는 염색용액으로 이번 실험에 꼭 필요한 용액이기도 하다.

 

 

3. DNA (Deoxyribonucleic acid)

DNA란 진핵세포 내 핵 안에 존재하는 디옥시리보스를 함유하는 핵산 구조를 말하며, 이중나선형의 구조를 취한다.

RNA와 단백질을 암호화하는 정보를 저장하며, 유전 정보를 딸세포에게 전해준다.

DNA는 Adenine, Guanine, Cytosine, Thymine의 4가지 염기로 구성되어 있으며, 각각 A, G, C, T의 약자로 표현한다. 4가지 염기의 배열에 따라 다양한 유전 정보를 나타낸다.

Deoxyribonucleic acid에서 Deoxy는 산소가 없음을 뜻한다.

 

4. RNA (Ribonucleic acid)

RNA란 진핵세포 내 핵 안에 존재하는 리보스를 함유하는 핵산 구조를 말하며, 단일 가닥 구조를 취한다. 구조상 DNA보다 덜 안정적이며, 돌연변이가 일어날 확률이 상대적으로 높다. 단백질을 암호화하는 유전정보를 운반하고 단백질 합성을 돕는다. RNA는 Adenine, Guanine, Cytosine, Uracil의 4가지 염기로 구성되어 있으며, 각각 A, G, C, U의 약자로 표현 한다.

	당	구조	염기	역할
DNA	디옥시리보스	이중 나선 구조	A, G, C, T	유전정보 저장 및 전달
RNA	리보스	단일 가닥 구조	A, G, C, U	유전 정보 전달 및 단백질 합 성에 관여

 

5. 염색체(Chromosome)

세포가 분열하여 딸세포에게 유전정보를 전달하기 위해 염색사가 히스톤(histone) 단백질과 함게 꼬이고, 응축되 어 X자 형태의 구조물을 이룬 것. 염색체는 세포 분열 과정에서만 관찰된다. (그 외의 과정에는 염색사로 존재함.)

6. 세포의 유전정보 이용 (Central Dogma)

7. 전기영동 (Agarose gel electrophoresis)

전기장의 영향을 받아 하전 된 물질들이 유동성 매체 내에서 이동하는 성질을 이용함. DNA의 구성 성분인 인산(PO4-)로 인해 DNA 분자는 음전하를 띈다. 따라서, DNA 분자를 agarose gel 속에 넣고 전장을 걸어주면 음전하를 띄는 DNA 분자는 agarose 속에서 (-)에서 (+) 방향으로 이동하게 된 다. 이때, DNA 분자는 크기가 작을수록 빨리(같은 시간 내에 멀리) 이동한다. EtBr (Ethidium bromide)은 DNA 염기 사이에 끼어들어 DNA가 UV를 받을 때 형광빛을 낸다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 브로콜리, 믹서기, 250㎖ 비커 2개, 거즈, 퐁퐁세제(계면 활성제), 소금물(NaCl)

2) 에탄올(100%, 70%), 스포이드, 나무막대, 유리튜브, e-tube, 파이펫, TAE buffer

3) 4℃ Centrifuge, 삼각 플라스크, Agarose powder, TAE buffer, 랩, 전자레인지, Comb

4) gel casting cassette, 1kb marker, loading dye, 파라필름, 파이펫

실험 방법

1. 실험 과정

1) 브로콜리를 믹서기로 갈아준다.

 

2) 믹서기로 갈아준 브로콜리를 250㎖ 비커에 1/3 채워준다.

 

3) 세제를 1.5㎖, NaCl 용액을 3㎖ 분주하여 고루 섞어준 후 30분간 실온에 놔둔다

 

4) 30분동안 Agarose gel을 만든다

① agarose gel powder와 TEA buffer을 섞고 입구를 랩으로 감싸준다.

② 전자레인지에 넣고 타이머를 돌려준다.

③ agarose gel이 끓으면 타이머를 끄고 식힌 후 다시 타이머를 돌리는 식으로 agarose gel이 완전히 녹을 때 까지 끓여준다. (끓어 넘치지 않도록 주의)

④ 다 녹은 agarose gel을 실온에서 식혀준다.

⑤ gel casting cassette를 준비하고 거품이 생기지 않도록 주의하며 gel을 부어준다.

⑥ 그 위에 12 well Comb을 꽂아준다.

⑦ 30분정도 놔둬 gel을 굳힌다.

⑧ gel이 다 굳은 후 TEA buffer을 살짝 부어서 gel을 촉촉하게 적셔주고gel이 찢어지지 않게 조심하며 Comb을 빼준다.

⑨ Agarose gel을 전기영동 Tank로 옮긴 후 TAE buffer로 채워준다.

⑩ 전기 adaptor을 연결하여 전기영동 준비를 마친다.

 

5) 거즈를 이용하여 브로콜리 Mixture을 걸러준다.

 

6) 걸러준 브로콜리 액체 3㎖을 유리튜브에 분주한다.

 

7) 차갑게 준비해둔 100% 에탄올을 스포이드를 이용해 6㎖를 분주한다.(아주 조심스럽게 벽면을 타고 천천히 흘려줘야 DNA회수율이 높아진다.)

 

8) e-tube에 미리 labelling을 하고 70% 에탄올 500㎕을 분주해 둔다.

 

9) 하얀덩어리로 응집된 DNA가 에탄올층 위로 떠오르면 이것을 나무막대기를 이용하여 거둬들인다.

 

10) DNA 덩어리를 70% 에탄올 e-tube로 옮긴다.

 

11) 파이펫을 이용하여 조심스럽게 resuspension시킨다.

 

12) 4℃ centrifuge를 사용하여 13,000 rpm에서 1min간 원심분리한다.

 

13) 상층을 버린 후, 공기중에 말린다. (에탄올이 최대한 남아있지 않도록)

 

14) TAE buffer 40㎕를 분주한 후 고루 섞어준다.

 

15) 파라필름위에 필요한 수만큼의 loading dye를 2㎕씩 분주한다.

 

16) loading dye에다가 10㎕의 DNA 시료를 섞어준다.

 

17) 전기영동 Tank안의 agarose gel well에 순서대로 loading한다. (12㎕씩)(양 끝 쪽 well은 3㎕씩marker를 분주한다.)

 

18) 전기영동Tank 뚜껑을 닫고, 100V에서 30min 전기영동을 수행한다.

 

19) 전기영동이 끝난 후, EtBr solution에서 15min간 염색한다.

 

20) DW에서10min간 washing한 후UV transillumination에서 관찰한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

추출한 브로콜리 DNA 전기영동

Marker : DNA ladder, 전기영동 된 DNA size를 확인

 

토의 사항

1. 실험 고찰

DNA를 추출하는 실험을 통해, 식물 세포의 DNA 추출방법을 익히고 세포의 유전 물질에 대해 알아보는 실험을 했다. 먼저, DNA와 RNA는 모두 핵산으로 은 아래의 표와 같다. 전기영동은 전기장의 영향을 받아 하전된 물질들이 유동성 매체 내에서 이동하는 원리로 실험에서는 agarose gel 내에서 이동하는 모습을 관찰했다.

DNA의 경우, 구성 성분인 인산기로 인해 전체적으로 음전하를 띈다. 따라서 전기영동 시, agarose gel 속에서 (-)→(+) 방향으로 이동하며 DNA 크기에 따라 분리 된다. 이때 DNA의 크기가 클수록 gel이 DNA의 이동을 방해하기 때문에 느리게 움직이게 되어 결과지의 위쪽 (출발점과 가깝게) 위치하게 된다. 

실험에서는 뚜렷하게 관찰되지 않았지만 브로콜리 찌꺼기를 거른 후, 차가운 에탄올을 넣어주었을 때 실 모양으로 뭉쳐 떠오르는 것이 DNA라는 것을 알 수 있었다. (차가운 에탄올은 눈으로 관찰하기 쉽게 추출된 DNA를 풀리도록 돕는 역할이다.) 실험에서는 M(marker)와 브로콜리 DNA를 전기영동하였다. M(marker)는 크기를 알고 있는 DNA 조각들을 섞어둔 것으로 실험에 쓰인 DNA의 크기를 비교할 수 있다. 

DNA marker와 비교했을 때, 브로콜리의 DNA가 비교적 위 쪽에서 관찰되었고 눈으로 관찰한 크기도 크므로 브로콜리의 DNA 크기가 크다는 것을 알 수 있었다. 이번 실험을 통해 DNA의 전기영동 과정과 식물의 잎에서 DNA를 추출하는 과정별 이유에 대해 알 수 있었다.