[일반생물학실험]구강 내 미생물 관찰 : 충치 감수성의 결정

실험 목적

1. 충치의 원인 미생물을 관찰한다.

2. 충치에 걸리기 쉬운 감수성을 실험을 통해 증명한다.

실험 이론 및 원리

1. 충치의 생성기작

Lactobacillus acidophilus, Streptococcos mutans, Actinomyces odontolyticus와 같은 다양한 박테리아들이 충치를 일으키는 것으로 알려져 있다. 구강에 서식하는 이들 미생물은 치아에 붙어 있는 탄수화물을 발효해서 유기산과 젖산을 생성한다. 이러한 젖산이 치아의 표면에 계속 존재하면 치아 표면의 에나멜층에서 석회질이 빠져나가고 약해져 결국에는 이에 작은 구멍이 생긴다. 

Streptococcos mutans에서 생성되는 dextran sucrase(glycosyl transferase)라 불리는 효소는 설탕을 글루칸(glucan)과 같은 거대한 중합체와 단당류인 과당으로 중합할 수 있다. 이 다당류는 치아에 단단히 달라붙어 플라그를 형성하고 여기에 Streptococcoci가 서식하면서 과당을 젖산으로 발효한다. 마찬가지로 Lactobacillus acidophils 역시 탄수화물 발효의 최종 산물로 젖산을 생성한다. 이 중의 몇몇 종류는pH 2.0에서3.0 사이의 산성 환경을 만들어낼 수 있다. 구강 Lactobacilli는 구강 내에 존재하는 포도당을 대사하여 구강 내 산성도를 pH 5.0 이하로 만들 수 있는 유기산을 생산한다. 이런pH 환경에서는 탈석회화가 일어나고 치아의 약화가 시작된다.

 

2. Snyder test

충치의 감수성을 결정하기 위해 널리 사용되는 미생물학적 방법이 ‘Snyder test'이다. 원리는 포도당과 Lactobacilli 와의 반응에 의해서 생성된 산의 양을 측정하는 것이다. 이 테스트는Snyder agar라는 배지를 사용한다. Snyder agar에는 포도당과 배지를 초록색으로 보이게 하는pH 지시약인bromo cresol green이 들어 있다. 타액에 들어 있는 Lactobacilli 를Snyder agar 위에 배양하면 미생물이 배지에 포함된 포도당을 발효하여 산을 형성하고 결과적으로 배지의pH가 낮아져 초록색의 배지가 노랗게 변한다. 24~48시간 내에 배지의 색깔이 노란색을 나타내면 타액은 숙주의 감수성을 의미한다. 그러나 색깔의 변화가 관찰되지 않았다면 낮은 감수성을 의미한다.

 

3. 젖산

D·L·DL형의 광학이성질체가 있다. L-젖산은 해당과정의 최종 산물로서 피루브산의 환원에 의해 생성된다. 조해성이 강한 막대 모양 결정이며, 녹는점은16.8℃이다. 근육·동물조직 속에 존재하며 사람의 혈액 속에는100mℓ당5∼20㎎이 존재하며, 심한 운동에 의해 증가한다. 운동에 의한 근육의 피로는 글리코젠의 분해에 의한 L-젖산의 축적과 관계가 있다. 휴식 시에는 그 일부가 산화 분해되지만 대부분 원래의 글리코젠으로 재합성된다.

화학식	C3H6O3
분자량	90.08g/㏖
녹는점	53℃(L), 53℃(D), 16.8℃(D/L)
끓는점	122℃(12mmHg)
비중	1.2

그림 1. 젖산의 구조

D-젖산은 두꺼운 판 모양 결정이며, 녹는점은 52℃이다. DL-젖산은 무색의 시럽상 액체로 식물이나 산패한 물질, 요구르트 등의 발효유, 젖산균 음료에 함유되어 있다. 녹는점은16.8℃이다. 상압에서 증류하면 탈수반응이 일어나서 분해되나 감압하의 끓는점은120℃(12mmHg)이다. 물·알코올·에테르에 잘 녹으며, 키니네염 등을 만들어D형과L형으로 분리시킬 수 있다. 젖산균에 의한 젖산발효로 생성되는 것을 발효젖산이라고 하는데, 이것은 균의 종류에 따라D·L·DL-젖산 중 어느 하나로 된다.

 

젖산은 현재 모두 녹말질·당질류를 원료로 하여 발효법에 의해 제조되고 있다. 신맛이 나고 식용으로는 과실엑스·시럽·청량음료의 산미제로 이용되며 주류(酒類)의 발효 초기에 가해서 부패균의 번식을 방지하는 데도 사용된다. 공업용으로는 염료의 발염제, 산성 매염제, 피혁의 탈회제, 합성수지의 원료 등으로 사용된다. 젖산칼슘은 식품의 칼슘 강화에, 젖산나트륨은 글리세린의 대용, 담배의 습도조절제로 사용된다. 젖산의 에스터는 도료의 용제로 사용되는 외에 플라스틱의 성질개량제로 이용된다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

① 침, Snyder test agar가 들어 있는 시험관, Hot plate, 쇠클램프, 타이머

② 15㎖ Falcon tube, Micro pipet, 수조(물중탕), 온도계, 면장갑

③ 1평방 인치의 파라핀 블록(껌), 얼음, 증류수

실험 방법

1. 실험 과정

① 2개의Snyder agar가 들어 있는 시험관에 표시를 한다.

② 열을 가해Snyder agar를 녹인 후45℃로 유지시킨다.

③ 실험조원 중 검사를 원하는 사람의 침을 얻는다. 준비된 파라핀 조각(껌)을 침을 삼키지 않고 3분간 씹은 후 멸균된 시험관에 흘러나온 침을 전부 모은다.

④ 모아진 침을 세차게 흔든 후 피펫을 이용해200㎕의 침을45℃에서 유지된Snyder agar 시험관 한 개에 투여한다.

⑤ 시험관을 손바닥사이에 끼우고 흔들거나 손가락으로 톡톡 쳐서 시험관 내의 물질이 충분히 섞이도록 한다.

⑥ 얼음 증류수에 접종된Snyder agar를 신속하게 냉각시킨다.

⑦ 두 번째 시험관을 이용하여 위의 ④에서 ⑥번 과정을 반복한다.

⑧ 두 시험관을 37℃에서72시간 배양한다.

실험 결과

1. 실험 관찰

① 72시간 배양하는 동안 배지의 색이 변했는지를 매일 확인한다. 대조구로 접종되지 않은 시험관을 사용한다.

우식성세균활성도	24시간 배양	48시간 배양	72시간 배양
왕성활성	양성
중등활성	음성	양성
경미활성	음성	음성	양성
불활성	음성	음성	음성

 

1. 대조군 2. Inactivate(Blue) 3. Limited(green) 4. Definite(yellow green) 5. Marked(yellow)

 

② 아래의 표를 이용해서 관찰 결과를 해석하고 결과를 기록한다.

충치 활성	배양시간
	24시간	48시간	72시간
강  함	양  성	-	-
중  간	음  성	양  성	-
작  음	음  성	음  성	양  성
없  음	음  성	음  성	음  성

 

- 양성 : 색깔이 완전히 바뀜. 더 이상 초록색이 남아 있지 않다.

- 음성 : 색이 전혀 바뀌지 않거나 약간의 색 변화가 일어남. 배지 전체에 초록색이 남아 있다.

 

③ 구강에 서식하는 박테리아들은 어떻게 충치를 유발하는가?

구강에 서식하는 미생물은 치아에 붙어 있는 탄수화물을 발효해서 유기산과 젖산을 생성한다. 이러한 젖산이 치아의 표면에 계속 존재하면 치아 표면의 에나멜층에서 석회질이 빠져나가고 약해져 결국에는 이에 작은 구멍이 생긴다. 

Streptococcos mutans에서 생성되는 dextran sucrase라 불리는 효소는 설탕을 글루칸과 같은 거대한 중합체와 단당류인 과당으로 중합할 수 있다. 이 다당류는 치아에 단단히 달라붙어 플라그를 형성하고 여기에 Streptococcoci가 서식하면서 과당을 젖산으로 발효한다. 

마찬가지로 Lactobacillus acidophils 역시 탄수화물 발효의 최종 산물로 젖산을 생성한다. 이 중의 몇몇 종류는pH 2.0에서3.0 사이의 산성 환경을 만들어낼 수 있다. 구강 Lactobacilli는 구강 내에 존재하는 포도당을 대사하여 구강 내 산성도를pH 5.0 이하로 만들 수 있는 유기산을 생산한다. 이런pH 환경에서는 탈석회화가 일어나고 치아의 약화가 시작된다.