[Vectors for Gene Cloning : Plasmids and Bacteriophages] 박테리오파지(Bacteriophages) - 2부

용원성 파지(Lysogenic phages)(λ 파지, M13 파지)

용원성 감염(Lysogenic infection)에서 숙주 세균내의 파지 DNA분자는 가능한 경우, 수천 번의 세포분열 동안 보존된다. 많은 용원성 파지(lysogenic phage) DNA는 세균 게놈(bacterial genome)내부로 삽입된다.

이 통합된 형태의 파지 DNA를 프로파지(prophage)라 하며 프로파지를 가지고 있는 세균을 lysogen이라 부른다. 그러나 프로파지는 결국 숙주 게놈으로부터 방출되어 파지 감염 사이클은 용균성 사이클로 전환된다.

λ의 감염 사이클은 전형적인 용원성 사이클이다. 용원성 파지(Lysogenic phage) 중 일부는 다른 감염 사이클(infection cycle)을 가지고 있다. M13이 E. coli에 감염하면 새로운 파지 입자(phage particle)가 연속적으로 조립되어 세포로부터 방출된다. M13 DNA는 세균 게놈에 통합되지 않으며 세포 용해(cell lysis)는 결코 일어나지 않는다.

Fig. 3 The lysogenic infection cycle of bacteriophage λ

1. λ DNA 분자의 유전자 구성

λ DNA 분자는 49 kb 이고 유전자 지도화(gene mapping)과 DNA 서열분석(sequencing) 기술에 의해 매우 많이 연구되어 왔다. 그 결과 대부분의 유전자들이 동정되고 위치가 결정되었다. λ DNA에서 관련된 기능의 유전자들은 게놈상에 서로 밀집되어 있다. 관련된 유전자들의 밀집(clustering)은 λ에 기초한 클로닝 벡터(λ-based cloning vector)의 제조에서 중요하다.

Fig. 4 The infection cycle of bacteriophage M 13.

Fig. 5 The λ genetic map, showing the positions of the important genes and the functions of the gene clusters

2. 선형 및 원형의 λ DNA

λ DNA의 두 번째 특징은 conformation이다. λ DNA는 파지 헤드 구조(phage head structure)안에 두 개의 free end를 가진 이중가닥의 linear형태이며, 각 말단에는 12개의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성된 단일가닥이 존재하고, 양 말단의 단일가닥은 서로 상보적이기 때문에 주입 후에는 완전한 이중가닥의 원형을 이룰 수 있다.

이러한 λ 점착 말단(sticky end)을 cos site라 부르며, cos site의 기능은 linear DNA가 감염된 숙주 세포내에서 원형을 이루게 해준다. 또한 rolling circle replication후에 concatamer를 하나의 genome단위인 monomer로 절단시키기 위한 endonuclease의 인식부위 역할을 한다.

Fig. 6 The linear and circular forms of λ DNA. (a) The linear form, showing the left and right cohesive ends. (b) Base pairing between the cohesive ends results in the circular form of the molecule. (c) Rolling circle replication produces a catenane of new linear λ DNA molecules, which are individually packaged into phage heads as new λ particles are assembled.

3. M13 - 섬유상 파지(filamentous phage)

M13은 filamentous phage로 λ와 전혀 다른 구조이다. M13의 게놈은 6407개의 뉴클레오티드(6.4 kb)의 단일가닥 DNA로 구성되어 있다. M13 DNA의 주입은 E. coli 세포의 편모(pilus)에 의해 일어나며 일단 주입된 단일가닥은 상보적인 가닥의 주형 역할을 하여 정상적인 이중가닥 DNA를 형성한다. 이 분자는 숙주 세균 염색체에 통합되지 않으면서 100 copy 이상 복제된다. 새로 생성된 입자(New phage particle)는 계속 조립되어 방출된다.

Fig. 7 The M13 infection cycle, showing the different types of DNA replication that occur. (a) After infection the single-stranded M13 DNA molecule is converted into the double-stranded replicative form (RF). (b) The RF replicates to produce multiple copies of itself. (c) Singlestranded molecules are synthesized by roiling circle replication and used in the assembly of new M13 particles.

4. 클로닝 벡터로서 M13의 매력

M13은 게놈 크기가 10 kb 이하로 벡터로서 바람직하고 이중가닥 형태의 replicative form(RF)은 플라스미드와 매우 유사하기 때문에 이와 동일한 실험목적을 위해 이용될 수 있다. 

가장 중요한 것은 M13에 기초한 벡터(M13-based vector)를 사용하여 클로닝된 유전자를 단일가닥 DNA형태로 얻을 수 있다는 것이다. 이러한 단일가닥 형태는 DNA 서열분석과 시험관내 돌연변이 생성(in vitro mutagenesis)과 같은 일부 기술에 이용가능하다.

다른 생물체를 위한 클로닝 벡터로서의 바이러스

대부분의 살아있는 생물체들은 바이러스에 감염되며, 따라서 바이러스가 고등생물체를 위한 클로닝 벡터로서 사용될 수 있는 것에 대한 지대한 관심은 당연한 것이다. 이것은 특히 플라스미드가 세균과 효모 이외의 다른 생물체에서 일반적으로 발견되지 않는다는 점을 상기해 볼 때 더욱 중요하다.

사실상 바이러스는 동물세포를 위한 클로닝 벡터로서 상당한 잠재력을 가지고 있다. Simian virus 40(SV40), adenovirus와 같은 포유동물 바이러스, 곤충을 위한 baculovirus 들이 지금까지 가장 관심을 끌고 있는 것들이며 다른 것들도 연구가 진행되고 있다. 

1. λ DNA의 특징

① λ DNA분자에서 유전자는 조직화되어 있다. 즉 동일 기능의 또는 연관성 있는 기능을 가진 유전자끼리 모여 있다.

② λ DNA의 크기는 49 kb로서 벡터로 이용하기 어렵지만, 관련유전자끼리 모여있어서조작자가 조작하기 용이하여 베터로 이용되고 있다.

∘ λ DNA는 linear form과 circular form으로 존재 가능

∘ linear form 

③ 양쪽 말단은 cohesive end(sticky end)이며 말단의 염기는 서로 상보적임(cos site)

∘ cohesive end(cos site)의 기능(역할)

④ 선형의 DNA → 원형의 DNA

⑤ rolling circle replication 후 제한효소가 인식하여 절단하는 부위

2. 파지 λ의 생활환(life cycle)

① 부착, 선형 DNA의 주입

② 원형화 : 원형이 되지 않으면 숙주 DNA에 통합 불가능

③ 통합(integration; prophage라 부름)

④ 세포 분열하다가 특정 조건에서 excision(절제), 용균성 사이클(lytic cycle)로 전환

3. 파지 M13의 생활환(life cycle)

① 부착, 단일가닥 DNA(ssDNA)의 주입

② 숙주세포의 효소 이용 ss → ds

③ M13 DNA 복제(ds DNA : 플라스미드와 동일한 form이므로 플라스미드 분리방법을 이용하여 M13 dsDNA분리가능)

④ 자손 phage 생성 후 방출

⑤ 감염된 세포는 성장과 분열을 계속함 - 감염여부 확인 : 증식 속도가 느려짐.

4. M13 DNA는 6.4 kb로 λ 게놈보다 훨씬 작다.

① M13 : 6.4 kb, 3 proteins

② λ : 49 kb, 15 proteins

5. M13 장점

① size가 작다

② ds form의 M13 DNA 분리 가능

③ ssDNA를 얻을 수 있다 - mutagenesis, sequencing 연구에 유용

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