[일반생물학실험]단백질의 전기영동

실험 방법

1. 실험 과정

1) 전기영동키트를 제작한다.

2) 수직방향으로 comb를 조심스럽게 제거한다. 이때 comb를 제거한 후 형성된 well이 손상되지 않도록 주의한다.

3) Comb를 제거한 후 즉시 주사기를 사용하여 각 well을 SDS-PAGE running 완충용액으로 수회에 걸쳐 세척한다.

4) 준비된 시료(catalase, lysozyme, albumin, whole cell lysate, protein size marker) 를 각 well에 각각 가한 후 200V로 1시간 정도 전기영동한다.

5) 전기영동이 끝나면 전기영동기구를 해체하고 gel판을 떼어낸다.

6) 유리판과 뒤쪽의 판이 깨지지 않도록 주의하고 gel이 찢어지지 않도록 한 다.

7) 전기영동이 끝난 gel을 Coomassie Brilliant Blue로 염색한다.

8) Destaining을 하여 실험결과를 관찰한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

실험은 왼쪽부터 1, 2, 3, 4, 5 lane이다.

1번 lane : 파란 줄이 gel 밑 부분에 몰려있다.

2번 lane : 파란 줄이 gel 중간부분부터 분리되어 있다.

3번 lane : 파란 줄이 gel 전반적으로 펼쳐져 있고 2개의 줄은 주황색으로 염색되어 있다.

4번 lane : 파란 줄이 중간 부분에 몰려 있다.

5번 lane : 파란 줄이 gel에 매우 촘촘히 분포되어 있다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

1) 각 lane별 분석

우선 가장 먼저 찾아야 할 것은 protein size marker이 다. 이 실험에서 사용한 marker은 ELPIS Biotech의 Dokdo이고 Cat NO.는 EBM-1032이다. 사진에서 도 볼 수 있듯이 이 marker의 특징은 70kDa와 25kDa 의 단백질은 주황색으로 염색되는 것이다. 이러한 사실로 보았을 때 3번 lane에서 protein size marker가 분리된 것을 알 수 있다.

두 번째로 확인해 볼 수 있는 lane은 5번 lane이다. 파란 줄이 매우 촘촘히 분포되어 있는 것으로 보아 매우 많은 단백질이 전기영동으로 인해 분리되 었다는 것을 알 수 있다. 따라서 whole cell lysate가 5번 lane에서 전기영동 으로 인해 분리되었다는 것을 알 수있다. (참고: whole cell lysate란 세포를 원심분리기를 이용해 상층액부분을 취한 것으로 세포의 단백질들이 들어 있다.)

세 번째로 확인해 볼 수 있는 것은 1번 lane으로 gel 밑부분에 몰려있는 것 으로 보아 매우 분자량이 작은 단백질이라는 것을 알 수 있다. 시료 lysozyme, catalase, albumin 중 lysozyme이 분자량이 15000g 으로 가장 작다. marker와 비교해 보았을 때 lysozyme의 질량은 15kDa 이하인 것으로 보인다. 네 번째로 확인해 볼 수 있는 것은 2번째 lane으로 중간 부분부터 줄이 펼쳐저 있는 것을 확인 할 수 있다. 즉 분자량이 동일한 단백질로 구성되어 있는 물질이 아니라는 것을 알 수 있다. 실제로 알부민 속에는 분자량 및 아미노산의 조성 등이 다른 여러 가지 단백질이 들어 있다는 것이 알려져 있다. marker와 비교해 보면 35～60kDa의 질량을 가진 단백질이 알부민을 구성한다는 것을 알 수 있다. 마지막으로 확인해 볼 수 있는 것은 4번째 lane으로 중간 부분에 줄이 몰려 있는 것을 볼 수 있다. 즉 분자량이 비슷한 폴리펩티드로 이루어진 단백질이라는 것으로 알 수 있다. 실제로 Catalase는 4개의 폴리펩티드로 이루어 진 효소이다. marker와 비교해 보았을 때 1개의 폴리펩티드의 질량은 60～70kDa인 것을 알 수 있다.

2) 3번 gel에서 marker가 전기영동되었을 때 15kDa와 7kDa가 뚜렷이 분리 되지 않은 이유

gel의 길이가 짧아 단백질이 gel 끝에서 걸려버린 것으로 보인다. gel의 길이가 더 길었다면 15kDa의 질량을 가지는 단백질과 7kDa의 질량을 가지는 단백질이 뚜렷이 전기영동에 의해 분리되어 보였을 것이다. 이러 한 현상 때문에 lysozyme의 질량을 정확히 파악하기가 어려웠다.

3) marker를 전기영동한 후 염색을 하지 않았는데 색이 나타나있는 이유

일반적으로 marker을 제작할 때는 미리 단백질을 염색해 둔다. 그리하여 전기영동 후 염색을 하지 않아도 색이 미리 나타나 있는 것이다.