[일반생물학실험] 확산(Diffusion), 원형질 분리(Plasmolysis), 용혈현상(Hemolysis) 1부

실험 목적

세포가 살아있는 동안에는 세포막을 경계로 끊임없는 물질의 이동이 일어나고 있다. 물질이동의 메커니즘을 알고, 이와 같은 물질의 이동방법을 실험을 통해 확인 할 수 있다.

 

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

Cellophane dialysis tubing을 이용한 첫 번째 실험은 삼투현상을 관찰한 실험으로 반투과막인 cellophane을 기준으로 안쪽과 바깥쪽의 농도를 다르게 해주어 삼투현상을 관찰해 보았었다. 이렇게 삼투현상을 관찰할 수 있는 장치를 osmometer라고 한다. 또한 서로 농도가 다른 solution을 이용하여 농도에 따른 삼투현상의 차이도 관찰할 수 있었다. 결과적으로 농도가 높을수록 삼투압이 높아지는데 이때 용매의 움직임이 이상기체의 움직임과 비슷하기 때문에 비례상수로 R(기체상수)가 쓰인다. 

두 번째, 세 번째 실험도 모두 삼투현상에 그 원리를 두고 있다. 두 번째 실험은 NaCl을 이용한 원형질 분리현상의 관찰로써 세포막의 반투과성(엄밀히 말해 세포막은 순수한 반투과성뿐만 아니라 선택적 투과성도 갖고 하지만 여기서 이는 무시한다.)을 이용한 것이다. 세포막의 반투과성에 의해 세포 외부의 농도를 높여주면 삼투현상에 의해 세포내부의 용매가 세포외부로 빠져나갈 테고 그로인해 세포는 쪼그라들게 된다. 이로 인해 세포막이 세포벽에서 떨어져 세포벽 안으로 쪼그라들게 되는데, 이것을 원형질 분리 현상이라고 한다. 

세 번째 실험 적혈구를 이용해 삼투현상을 관찰하는 것이었다. 체액의 NaCl의 농도는 0.9%이므로 0.9%의 NaCl을 등장액, 즉 0.9%의 NaCl을 slide glass에 넣어줬을 때 적혈구는 원반모양을 유지했었다. 하지만 10% NaCl의 경우 고장액이므로 적혈구안쪽의 용매가 외부로 빠져나가 적혈구가 쪼그라든다. 마지막으로 증류수의 경우 저장액이므로 적혈구 내부로 용매가 유입되고 적혈구가 내부의 수압을 이기지 못해 터지게 된다. 이것이 용혈현상(hemolysis)으로 적혈구가 땡땡해 지거나 구멍이 나서 터져버리면 관찰이 안 되는 경우도 있다.

 

2. 서론

세포의 물질 이동 메커니즘 중 비교적 작은 분자량을 지닌 물질의 이동은 주로 확산, 삼투, 능동 수송 등으로 이루어지게 되는데, 실험을 통해 위의 세 가지 현상에 대해 제대로 이해하고, 세포의 반응을 관찰한다. 이로써 세포의 물질 이동에 확인하고, 생물학에 대하여 이해하는데 도움이 될 것이다. 즉, 세포가 살아있는 동안에는 세포막을 경계로 하여 끊임없는 물질의 이동이 일어나고 있다. 

이러한 물질 이동 현상 중 비교적 작은 분자량을 지닌 물질의 이동은 주로 다음 세 가지 메커니즘에 의해 일어난다. 즉, 기체나 액체의 분자가 농도가 높은 곳에서 낮은 곳으로 이동하는 확산(diffusion), 반투과막(차등투과막)을 통해 용매 분자만이 확산되고 용질 분자는 확산되지 않는 삼투(osmosis), 그리고 에너지를 소모하며 농도 구배에 관계없이 물질이 이동하는 능동 수송(active transport)등이 그것이다. 본 실험에서는 여러 가지 세포에서 이와 같은 물질의 이동방법 중 주로 삼투현상에 의한 물질의 이동을 관찰해 보았었다.

 

3. 삼투현상(Osmosis)

삼투현상은 액체의 농도차이로 인해 발생하는데, 반투막을 경계로 저장용액의 용매가 고장용액으로 이동하는 현상이다. 다른말로 침투현상이라고도 한다. 소금물을 가지고 쉽게 설명해보면, 2%짜리 소금물과 5%짜리 소금물이 있다고 가정하자. 용액인 소금물에서 소금은 용질이고, 물은 용매이다. 그리고 여기에서 농도가 낮은 2% 소금물은 저장액(저장용액), 농도가 높은 5% 소금물은 고장액(고장용액)이다. 

그리고 반투막은 용매인 물은 통과시키나, 용질인 소금은 통과시키지 않는 막이다. 만일 어떤 큰 통의 가운데에 반투막을 설치하고 한쪽에 2%소금물, 다른 한쪽에 5%소금물을 넣어두게 되면 삼투현상을 볼 수 있다. 두 소금물의 높이는 처음에 같았으나 시간이 지날수록 저장용액(2%)의 물높이는 계속 낮아지고, 고장용액(5%)의 물높이는 계속 올라가게 된다. 이것은 저장용액의 용매가 고장용액 방향으로 이동한다는 것을 의미한다. 이렇게 저장용액의 용매가 계속 고장용액으로 가게 되면 저장용액의 농도는 높아지고, 고장용액의 농도는 낮아져 결국 두 용액의 농도가 비슷해지면서 삼투현상은 정지한다.

정확히 말하면 농도가 같아져 삼투현상이 정지되기 보다는 고장용액의 물높이가 높아지면서 발생하는 저항압력(역삼투압)이 커지게 되어, 그 압력이 저장용액에서 고장용액으로 가려는 용매의 압력(삼투압)과 같아지면서 삼투현상이 정지-평형상태를 이루게 되는 것이다. 이런 삼투현상이 일어나는 것은 농도차이 때문인데, 삼투현상에서 저장용액의 용매가 일방적으로 고장용액으로 이동하는 것 같지만 사실 저장용액과 고장용액은 계속 용매를 교환하고 있다.

다만 두 용액의 용매가 이동하는 양이 다르기 때문에 차이가 생기는 것이다. 고장용액에서 저장용액으로 가는 용매보다 저장용액에서 고장용액으로 가는 용매가 더 강한 압력을 가지고 있는데 이 압력을 삼투압이라고 한다. 이 삼투압에 의해 물의 높이차이가 발생하며, 물의 높이차이가 생기면 물이 높아진 고장용액에 압력이 걸리게 되는데 이 압력을 역삼투압이라고 한다. 간단히 말해서 농도차이가 나는 두 용액이 반투막으로 막혀 있을 때 저장용액에서 고장용액으로 용매가 이동하는 것이 바로 삼투현상, 저장액에서 고장액으로 용매가 이동하는 힘이 삼투압, 이로 인해 고장용액 쪽에 생기는 저항압력이 바로 역삼투이다.

그럼 왜 용매는 농도가 낮은 곳에서 높은 곳으로 이동하는가? 그 이유는 용질의 방해 때문이다. 원래 유체(기체, 액체)는 확산이라는 현상을 통해 농도를 맞추려는 성질이 있어 계속 이동하려고 한다. 이때에 반투막은 방해물 같은 작용을 하는데, 반투막의 내부는 그물과도 같아 크기가 작은 용매는 그 그물을 쉽게 통과하여 반대편으로 이동하지만 크기가 큰 용질은 그물에 걸려 이동을 못한다. 그런데 용질이 자기만 그물에 걸리는게 아니라 용매의 이동까지도 방해한다. 두 용액의 용질 농도가 다르다면 농도가 낮은 용액의 용매는 반대편으로 이동할 때에 용질의 방해를 덜 받지만, 농도가 높은 용액의 용매는 용질의 방해를 상대적으로 더 많이 받기 때문에 반투막을 경계로 한 용매의 이동하는 힘이 다르게 되어 삼투압이 발생한다. 결국 농도차이로 인해 생기는 삼투압에 의해 고장액 → 저장액으로의 용매이동 양보다 저장액 → 고장액으로의 용매이동 양이 많으므로 고장액의 높이가 높아지거나, 혹은 부피가 커질 수밖에 없다.

 

4. 원형질 분리(Plasmolysis)

식물세포를 그 세포액보다도 삼투압이 높은 용액 속에 담그면 세포액의 수분이 밖으로 빠져나와 그 때까지 세포벽에 밀착되어 있던 원형질이 세포벽에서 떨어져 수축하는 현상이다. 죽은 세포에서는 볼 수 없으므로 식물세포의 생사를 판별하는 데 흔히 이용된다. 원형질분리는 원형질막이 반투성을 가졌기 때문에 일어나므로 죽은 세포에서는 볼 수 없다. 

따라서 식물세포의 생사를 판별하는 데 흔히 이용된다. 또, 원형질분리가 막 일어나기 시작하는 외액(外液)의 농도를 조사하면 그 세포의 삼투압을 알 수 있다. 분리한 원형질 모양은 세포 종류나 외액의 조성에 의하여 철형(凸形)이 될 때와 요형(凹形)이 될 때가 있는데 이것에서 세포벽과 원형질막과의 부착력, 원형질막의 표면장력 등을 추정할 수 있다. 또한, 동물세포에는 세포벽이 없으므로 높은 삼투압의 용액 내에서는 세포 전체가 수축하고 원형질분리 현상을 볼 수가 없다.

 

5. 용혈현상(Hemolysis)

적혈구가 붕괴하여 헤모글로빈이 혈구(血球) 밖으로 용출하는 현상이다. 용혈현상은 정상적인 동물체의 혈관 내에서도 일어난다. 동물의 적혈구는 대체로 수명이 120일 정도 된다. 적혈구는 수명이 지나면 지라에서 파괴되고 이를 새로 만들어진 적혈구가 대체한다. 그러나 적혈구가 지나치게 많이 파괴되어 지라에 저장되지 못한 헤모글로빈이 혈액으로 방출되면 이 헤모글로빈이 파괴되어 황달이 발생하기도 한다. 적혈구가 지나치게 많이 파괴되는 경우 혈액의 산소 운반 능력이 떨어져 빈혈 현상이 발생한다. 이처럼 적혈구의 파괴 현상을 유발하는 것은 면역 반응이나 독소 등 여러 가지가 있다.

그 중 겸형적혈구빈혈(sickle cell anemia)은 유전적 원인으로 낫 모양의 적혈구를 생산하여 이러한 적혈구가 쉽게 파괴되어 생기는 빈혈이다. 용혈현상이 동물의 정상적 생리 현상으로 나타나기도 하지만 동물체 밖에서도 일어난다. 혈액을 장기 저장하는 경우나 저장 상태가 좋지 않을 경우 적혈구가 파괴되는 용혈현상이 발생한다. 또한 혈액에 물을 넣는 경우 적혈구의 삼투압이 높아져 적혈구가 터지거나, 주사기로 혈액을 강제로 흡입하거나 밀어낼 경우 물리적인 힘에 의하여 적혈구가 파괴되어 용혈현상이 일어나기도 한다. 수술 시 적혈구만 모아서 환자의 혈액에 투여하는 경우가 있다. 이럴 때 혈액을 원심분리하여 적혈구만 모으는 데 지나치게 높은 속도로 원심분리를 할 경우 적혈구가 용혈되기도 한다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 양파, 1N HCl, 10% NaOH 용액, 70% ethanol, 30%, 60% sucrose 용액(0.01% congo red함유)

2) 현미경(compound microscope), Cellophane dialysis tubing, 250ml beader 1개, 여과지

3) slide glass & cover slip, 실, Lancet, 1ml pipette, clamp & stand

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 삼투현상(Osmosis)

① Cellophane dialysis tubing1) 을 10㎝ 길이로 자르고, 이것을 증류수에 담가두어 막이 부드러워지도록 한 다음 준비된 dialysis tubing의 한쪽 끝을 실로 묶고 물을 넣어 물 이 새지 않는가를 확인한다.

② 한쪽 끝이 막힌 dialysis tubing에 Congo red (0.01%)를 포함한 30% sucrose 용액 을 5㎝ 높이가 되도록 넣은 후 공기를 빼고 끝을 묶어 밀봉한 다음, 이것을 1㎖ pipette에 묶어 osmometer를 설치한다. 같은 방법으로 60% sucrose 용액의 osmometer도 같이 설치한다.

③ 설치 후 처음 몇 분간 pipette의 눈금을 관찰하여 Congo red가 들어있는 sucrose용 액이 상승하는 것을 확인한다.

④ 용액의 상승이 확인되면 이후 5분 간격으로 용액이 얼마나 올라가는가를 기록한다.

2) 원형질 분리(Plasmolysis)2)

① 양파의 표피 세포 관찰 실험과 마찬가지 요령으로 0.5×0.5㎠ 크기로 자른 양파의 안쪽의 표피 세포층을 slide glass 위에 놓고 물을 몇 방울 떨어뜨린 후 cover slip을 덮고, 현미경하에서 양파 세포를 스케치한다.

② 10% NaCl용액 한 방울을 slide glass와 cover slip의 한쪽 면에 떨어뜨리고 반대편 에서 여과지로 이를 빨아들여 용액에 양파 표피 세포가 잠기게 한다. 100x 배율로 하 나의 세포를 1분 간격으로 5분간 스케치 한다. 어떤 변화를 관찰할 수 있는가?

③ 이번에는 slide glass와 cover slip의 경계에 증류수를 떨어뜨리고 반대편에서 여과지로 NaCl 용액을 빨아들여 양파표피 조직을 씻어낸 다음, 역시 1분 간격으로 5분간 동 일한 세포를 스케치 한다.

3) 용혈현상(Hemolysis)3)

① 손을 비누로 깨끗이 씻고, 손가락 끝을 70% alcohol로 닦아 소독하고 말린 다음 lacent으로 찔러 피가 나오게 한 후 3개의 slide glass위에 각각 1방울씩 떨어뜨린다.

② ①번 slide glass위에 0.9% NaCl용액을 한 방울씩 떨어뜨리고 피와 잘 섞어준 후 10 초 간 두었다가 cover slip을 덮고 관찰한다. 적혈구의 모습은 어떠한가?

③ ②번 slide glass위에 10% NaCl용액을 한 방울씩 떨어뜨려 피와 잘 섞은 후 10초간 두었다가 cover slip을 덮고 관찰한다. 이때 적혈구는 어떤 모습인가?

④ ③번 slide glass위에 증류수 한 방울을 더하여 피와 잘 섞은 후 10초간 두었다가 cover slip을 덮고 관찰한다. 적혈구는 어떤 모습인가? 용혈현상을 관찰할 수 있는가?

각주

1) Cellophane dialysis tubing을 사용할 때에는 사용하기 전에 증류수에 담가두어 막이 부드러워지도록 한다.

2) 원형질 분리가 잘 일어나지 않으면 NaCl을 추가적으로 더 넣어준다. 원형질 분리가 일어난 후 다시 증류수를 넣어줬을 때 원상복구가 잘 되지 않으면 증류수를 과량 넣어준다.

3) 혈액을 다루는 실험이므로 실험도구와 신체의 혈액 채취 부위를 청결히 한다.

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