[생화학개론]효소의 고정화(고정화 효소) 5부






효소의 대규모 생산


대량으로 생산되고 있는 효소로는 단백질 분해효소인 subtilisin, rennet, 가수분해효소인 펙틴 분해효소(pectinase), 지질 분해효소(lipase), 유당 분해효소(lactase), 포도당 이성화효소(glucose isomerase), 그리고 포도당 산화효소(glucose oxidase)가 있다. 이러한 효소들은 과잉생산균주(over producing strain)로부터 생산된다.


생물체로부터 특정한 효소를 분리, 정제하기 위해서는 세포를 파괴하여 세포찌꺼기와 핵산을 제거한 후 단백질을 침전시키고 원하는 효소를 한외여과(ultrafiltration)와 크로마토그래피를 이용하여 분리하고 결정화(crystallization)와 건조하는 과정 등이 필요하다. 공정의 체계는 생성된 효소가 세포 내부에 남아 있는가(intracellular enzyme) 혹은 세포 외부에 있는가(extracellular enzyme)에 따라 달라진다.


효소를 대규모 생산하는 공정의 첫 단계는 효소를 생산하는 생물체를 배양하는 것이다. 이때 생산 조건을 제어하여 효소의 과잉생산을 위하여 배양 조건을 최적화할 수 있다. 단백질 분해효소는 과잉생산 균주인 Bacillus, Aspergillus 등을 이용하여 생산하고, 펙틴 분해효소는 Aspergillus niger, 유당 분해효소는 효모나 Aspergillus를 이용해 생산한다. 지질 분해효소(lipase)는 효모나 곰팡이에 의해 생산된다. 포도당 이성화효소는 Flavobacterium arborescens나 Bacillus coagulans에 의해 생산된다.


효소배양 방법에는 고체배양과 액체배양이 있다. 고체배양은 일반적으로 곰팡이의 세포 외 효소(extracellular enzyme) 생산에 적합한 방법이고, 액체배양은 모든 미생물의 효소생산에 적용되는 방법이다. 액체배양이 고체배양에 비하여 좁은 면적에서 가능하며, 관리가 쉽고, 기계화가 가능하며, 대량생산에 알맞다. 그러나 생산된 효소의 역가가 고체배양의 추출액보다 약간 떨어진다.



배양단계가 끝나면 배지로부터 세포를 분리하는데, 보통은 여과(filtration)를 이용하나 때로는 원심분리도 이용된다. 생성된 효소가 세포 안 또는 세포 밖에 있느냐에 따라 효소의 분리, 정제를 위해서 세포나 배양액을 더 처리하기도 한다. 세포 내 효소(intracellular enzyme)의 회수는 세포 외 효소(extracellular)의 회수에 비하여 더 복잡하여 세포의 파쇄, 세포 찌꺼기와 핵산의 제거가 수반된다.


어떤 경우에는 효소가 세포 안과 밖에 공존하는 경우가 있다. 이러한 경우에는 배양액과 세포를 동시에 처리하여야 한다. 세포 내 효소는 세포막의 투과성(permeability)을 향상 시켜 배양액으로 분비시킬 수도 있다.


이러한 목적을 위해 CaCl2와 같은 염(salt)이나 DMSO(dimethylsulfoxide)와 같은 화학약품 또는 pH 전이(shift)가 사용되고 있다. 효소의 분비가 완전하지 않다면 세포를 파괴해야만 한다.이러한 공업적 효소를 생산하는 데 사용되는 공정들은 유전자 재조합으로부터 단백질을 생산하는 공정에서도 공통적으로 이용되고 있다.



고정화 효소의 특성


고정화됨으로써 효소는 부분적으로 수식되기도 하고, 고분자의 gel이나 엷은 막으로 싸이기도 한다. 따라서 고정화 효소는 고정화하기 전에 비하여 조금씩 다른 성질을 나타내는 경우가 있다. 고정화에 의해서 일반적으로 활성이 저하되는 경우가 많고, 기질특이성이 변화되기도 한다. 또 효소를 고정화하면 효소단백질의 전자 상태가 변화하는 동시에 담체 표면의 전하의 영향을 받아서 효소반응의 pH 의존성이 바뀌어 최적 pH가 변화하는 경우가 있다. 


이와 같은 pH 의존성의 변화에는 어느 정도 규칙성이 있으므로, 고정화하는 방법을 선택함으로써 효소 원래의 최적 pH를 효소 이용에 적합한 pH로 변화시켜 사용하기에 편리하도록 하는 것도 어느 정도 가능하다. 고정화에 의해서 효소는 열, pH, 유기용매, 단백질변성제, protease, 효소저해제 등의 외부인자에 대해서 안정성이 증가하는 장점도 있고, 연속반응시의 안정성 또는 보존성이 좋아지는 경우도 많다.


이와 같은 변화가 생기는 이유는

① 고정화 과정에서 효소활성중심의 아미노산 잔기의 일부가 파괴되거나 결합에 관여하고,


② 효소단백질의 고차구조가 변화하며,


③ 기질 또는 반응생성물의 확산이나 막 투과로 인하여 효소반응이 완만해지기도 하고,


④ 고정화용 담체의 입체적 장해 때문에 기질이 효소에 접근하기 어렵게 된다는 점을 생각할 수 있다.





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