[미생물학실험]Live cell 관찰 및 배지제작 1부

실험 목적

Observation of live cells and making culture media

 

실험 이론 및 원리

1. Culture medium의 종류

1) 액체배지 : 배지 내에 agar 성분이 들어있지 않은 배지로 액체 상태이다.

2) 고체배지 : 배지 내에 agar 성분이 약 1.3～1.5% 함유된 배지로 고체상태이다.

3) 사용목적에 따라 다음과 같이 분류한다.

① 평판배지 - 배양접시에 약 4㎜ 두께(15～20㎖) 정도 넣어 굳힌 것이 평판배지인데 주로 세균의 분리배양, colony의 관찰, 용혈능 관찰 등에 이용된다.

② 고층배지 - 시험관을 세운 상태로 배지를 굳힌 것으로 반유동배지이며 주로 세균의 성상검사 균주의 보존, 세균의 운동성 등에 이용된다.

③ 사면배지 - 시험관에 배지가 약 45˚ 경사가 되도록 굳힌 것으로 세균의 증식, 보존 등에 쓰인다.

④ 반사면배지 -고층배지의 상부 1/3 정도를 경사지게 만든 것으로 세균의 생물학적 성상검사 등에 쓰인다.

4) 반고체배지 : 배지 내에 agar 성분이 약 0.3～0.5% 함유된 배지로 반고체상태를 이룬다. 이 배지는 세균의 운동성 관찰과 세균의 보존 및 수송에 이용된다.

 

2. Sterilization 주의 사항

실험에서는 대부분 한 미생물만 배양하는 pure culture을 실시한다. 따라서 autoclave에 121도, 15분 동안 돌려서 무균상태로 만들어 제작한 다음 목적의 미생물을 접종하는 것이다. 배지를 petri dish에 옮기는 것은 clean bench에서 이루어져야한다. 배지를 옮기기 전 미리 clean bench 내 UV를 쪼여 안의 환경과 plate등의 기구들을 멸균해 놓는다. 70% 알코올로 손 부위를 소독하고 알코올램프로 뚜껑부위를 화염멸균한 후 배지를 옮긴다. 배지를 부은 후 upside down 하여 보관한다.

이외에도 배지를 만든 후에는 반드시 clean bench에서 충분히 petri dish를 잘 건조시킨 후 랩에 싸서 보관해야 한다. 랩으로 꼼꼼히 잘 싼 후에 4도 이하 냉장실에 보관해야 한다. 냉장실에는 세균의 증식이 일반적으로 없지만 곰팡이의 증식은 활발하기 때문에 설사 배지를 뒤집어서 보관하더라도 습기로 인해서 배지가 오염이 될 확률이 높다.

사면배지는 조제하여 세워두면 아래에 수분이 차는 데, 거꾸로 뒤집으면, 수분이 배지 표면에 묻게 되어 미생물이 표면 전체에서 생육하게 되므로, 시험관을 똑 바로 세운 채로 실험을 한다. 또한 petri dish에는 적절한 공기의 유입을 위해 밑 부분과 뚜껑 사이에 적당한 간격이 있는데 이 공기의 유입은 세균의 성장에 매우 중요한 요건으로 바로 놓았을 때보다 뒤집었을 때 공기의 유입이 더 용이하게 된다.

3. Clean bench 사용시 UV 살균의 원리

1) UV sterilization의 mechanism과 특징

UV에 의해 cell안의 핵산(DNA)을 이루고 있는 성분이 UV energy에 의해 깨어짐으로서 bacteria와 virus가 죽고, nucleus주위의 수분이 UV energy에 의해 H+ 와 OH-로 분리되고 OH radical은 인근의 물 분자를 자극하여 물 분자의 balance를 깨트림으로서 cell wall이 치명적으로 손상을 받아 bacteria와 virus가 사멸한다. cell 내의 핵산(DNA)이 UV의 에너지에 의해 cell자신의 metabolism 장애가 초래되어 증식능력을 잃어 cell의 수가 감소한다고도 하지만 학술적으로 정확한 mechanism은 이론의 여지가 있다.

2) Sterilization effect of UV

UV의 살균효과는 UV의 파장에 따라 전혀 달라지며, 250∼260nm 파장의 uv가 가장 효과적이다. 250∼260nm 파장에서의 살균효과는 피 조사되는 적산UV량(방사강도×조사시간)에 정비례 하는 관계가 있다. 더구나 자외선 살균효과는 수십 수백 종의 균종과, 아직 알려져 있지 않는 새로운 virus에 대해서도 비슷하다. 특히 새로 생기는 변종에 대한 살균 효과도 기존의 알려진 virus와 비슷하다 것은 약품에 의한 살균 보다 매우 큰 장점이다. 균의 생존율은 조사량(방사강도×조사시간)에 대해 거의 지수함수 적으로 감소한다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) Clulture medium : nutrient broth(0.8%), agar powder(1.5%), D.W, mass cylinder, beaker, petri dish, wrap, erlenmeyer flask, magnetic bar, stirrer and micropipette

2) Live cells observation : tip, microscope, slide glass, cover glass and i㎜ersion oil

3) Autoclave : Autoclave는 고온 고압의 상태에서 증기로 쐬어 줌으로서 멸균을 시킨다. 용기 내의 온도는 150～600℃이고, 기압은 250∼1,200atm이다. 바닥에는 가열을 할 수 있는 전열선이 있고 여기에 증류수를 넣어주게 된다. 현재 일반적으로 121℃에서 15분간 멸균을 시행하게 되면 모든 미생물이 다 죽는 것으로 알려져 있다. Autoclave는 정해진 시간이 지나면 자동으로 압력이 빠지는 방식으로 되어있기 때문에 정한 시간 후 기다렸다가 뚜껑을 열면 되는데 너무 높은 온도에서 무리한 힘으로 열다보면 수증기가 강하게 튀어나올 수 있으므로 주의해야 한다.

4) Imersion oil의 역할 : 보통 1000배의 배율에서 관찰시 이 oil을 사용한다. 1000배는 고배율인 관계로 표면에서 빛이 반사되는 것에 의해 생기는 빛의 손실을 막아 상을 더 밝고 명확하게 한다.

 

실험 방법

1. 액체 배지

1) Erlenmeyer flask에 물 100㎖를 재서 넣어준 후 erlenmeyer flask 바깥부분에 네임펜으 로 양을 표시해 둔다.

2) 물을 조금 비워 낸 후 0.8g 의 nutrient broth를 넣는다. stirrer 위에 올려 magnetic bar 를 넣고 가루를 녹인다. 그리고 미리 비워 낸 물을 다시 채우기 위해 증류수를 미리 표시해 둔 눈금에 맞춰 더 넣어준다.

3) 가루가 모두 녹은 후 micropipette을 이용하여 5㎖씩 모든 tube에 넣어준다.

4) 튜브뚜껑을 닫아 autoclave에 121℃로 15분 동안 멸균 시켜준다. (Autoclave에 넣기 전 tube 뚜껑을 닫은 후 그 위를 호일로 씌워주면 최소한의 오염을 막아 줄 수 있다.)

5) 80℃ 정도가 되면 빼서 굳힌다.

 

2. 고체 배지

1) Beaker에 물 500㎖를 재서 넣어준 후 beaker 바깥부분에 네임펜으로 양을 표시해 둔다.

2) 물을 조금 비워 낸 후 4g 의 nutrient broth를 넣는다. Stirrer 위에 올려 magnetic bar를 넣고 가루를 녹인다. 그리고 미리 비워 낸 물을 다시 채우기 위해 증류수를 미리 표시해둔 눈금에 맞춰 더 넣어준다.

3) 여기에 액체배지를 굳혀 고체배지를 만들기 위하여 7.5g 의 agar 를 넣어 준 후 다시 stirrer 위에 올려 잘 녹여준다.

4) Beaker에 wrap을 씌우고 구멍을 몇 개 뚫어 준 후 전자레인지에 돌린다. 이때 agar가 녹 으면서 거품이 생기는데, 그러면 잠시 빼내 beaker를 흔들어 거품을 없애 준 후 계속 전자 레인지에 돌린다. 이러한 과정을 반복하며 agar를 모두 녹인다. 이때 들어 있던 magnetic bar가 움직이거나 거품이 더 이상 올라오지 않는다면 모두 녹은 것이다.

5) 배지를 erlenmeyer flask에 옮기고 고무마개를 덮고 호일을 씌운 후 Autoclave를 이용해 멸균처리를 한다.(121℃, 15분)

6) 깨끗이 청소와 소독된 clean bench에서 멸균된 plate에 멸균된 medium을 plate의 78%정 도만 부은 후 plate를 기울여 바닥에 모두 깔리게 한다. 그리고 굳힐 때에는 plate를 뒤집 어서 굳힌다.

 

3. Live cells 관찰과정

1) Clean bench를 사용하기전에 UV를 켠다.(최소5분)

2) Light와 fan을 키고 70%알코올로 손을 소독한다.

3) Clean bench내에 손을 넣어 tip을 화염멸균한다.

4) 고체배지에서 균를 떠낸 후 배지를 upside down시켜 놓는다.

5) Slide glass에 pipette을 이용하여 D.W.를 소량 떨어뜨린 후 cover glass로 덮고 그 위에 i㎜ersion oil을 떨어뜨린 후 제물대에 올린다.

6) Live cell의 관찰을 위해 microscope를 처음 1000배의 배율로 맞추고, 초점을 맞춘다.

7) Live cell의 motility, lenth, width, shape 등을 관찰한다.

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