[일반생물학실험]탄수화물 및 단백질 정성실험 2부

실험 기구 및 시약

1. 탄수화물 정성실험

1) 미지시료 : 1% glucose solution, 1% maltose solution, 1% sucrose solution, 1% starch solution, 증류수

2) Benedict reaction, Barfoed reaction, I2-KI solution, 10N HCl, 10 NaOH

3) test tube, dropping pipette, micropipette, rack, alcohol, 집게, 삼발이, 성냥

 

2. 단백질 정성실험

1) 1% albumine solution, 1% glycine solution, 1% tyrosine solution, 1% biuret solution

2) 1% starch solution, 0.1% Ninhydrin, Millon's regent, Biruet reagent, 30% HNO3, 40% NaOH

3) test tube, 5ml pippete, pasteur pipette, 알코올 램프, 비커, 삼발이, 집게, 석면

실험 방법

1. 탄수화물 정성실험

1) Benedict reaction

① 5개의 시험관에 2ml씩 베네딕트 시약을 넣는다.

② 시료를 ①에서 준비한 시험관에 각각 0.5ml씩 넣고 섞는다.

③ 끓는 물에서 중탕을 시킨 후 실온에서 방치하여 식힌 다음 반응을 기록한다.

 

2) Barfoed reaction

① 2개의 시험관에 2ml의 바포드 시약을 넣는다.

② 베네딕트 시험에서 양성반응을 보인 시료를 각각 0.5ml씩 가한 후 끓는 물에 2분간 중탕 시긴 후에 냉각시켜 침전이 생기는지 관찰한다.

 

3) Iodine reaction

① 3개의 시험관에 0.5ml의 요오드 용액을 넣는다.

② ①의 시험관에 베네딕트 시험에서 음성 반응을 보인 시료를 각각 0.5ml씩 가한 후 잘 섞은 다음 색의 변화를 관찰한다.

 

4) Sucrose reaction

① 요오드 시험에서 음성반응을 보인 미지시료를 0.5ml씩 2개의 시험관에 넣는다.

② 위의 시험관에서 10방울의 HCl을 넣고, 끓는 물 속에서 5분간 중탕한다.

③ 이 산성 용액을 중화시킨 후(NaOH 10방울을 넣는다.) 반응을 관찰한다.

 

2. 단백질 정성실험

1) Ninhydrin reaction

① 시험관에 미지시료를 각각 2ml씩 넣는다.

② 0.1% ninhydrine solution을 5방울 정도 가한다.

③ 끓는 물에 5~10분 간 중탕시킨 후 색의 변화를 관찰한다.

 

2) Millon's reaction

① 시험관에 미지시료를 각각 2ml씩 넣는다.

② 여기에 Millon 시약 (15%(v/v)) H2SO4에 HgSO4를 15%되게 녹인 용액) 1ml씩 넣는다.

 

3) Biuret reaction

① 시험관에 미지시료를 각각 2ml씩 넣고 HNO3을 1ml씩 첨가한다.

② 끓는 물에서 5~10분 간 중탕시킨 후 색의 변화를 관찰한다.

③ 이를 냉각시킨 후, 2ml의 40% NaOH를 첨가하여 알칼리화 시키고 그 때의 색의 변화를 관찰한다.

 

(4) Xanthoprotein reaction

① 시험관에 미지시료를 각각 1ml씩 넣은 후 HNO3을 1ml씩 넣는다.

② 끓는 물에서 5~10분 간 중탕시킨 후 색의 변화를 관찰한다.

③ 이를 냉각시킨 후, 2ml의 40% NaOH를 첨가하여 알칼리화 시키고 그 때의 색의 변화를 관찰한다.

실험 결과

1. 탄수화물 정성실험

탄수화물	Test
	Benedict reaction	Barfoed reaction	Iodine reaction	Sucrose reaction	시료
미지시료 1	○	○	-	-	단당류
미지시료 2	×	-	×	○	수크로오스
미지시료 3	×	-	○	-	녹말
미지시료 4	○	×	-	-	다당류
미지시료 5	×	-	×	×	D.W.

 

2. 단백질 정성실험

시약 시료	Ninhydrin reaction	Millon's reaction	Biuret	Xanthoprotein reaction
				HNO3	NaOH
미지시료 1	×	무색→거품	진보라색	노란색	노란색
미지시료 2	무색→자색	×	×	×	×
미지시료 3	×	×	×	×	×
미지시료 4	×	×	×	투명한 노란색	진한 노란색
미지시료 5	×	×	연한 보라색	×	×

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험은 미지의 시료를 탄수화물과 단백질의 각 물질들의 특성을 이용해 정성해 보는 것 이었다. 각 실험별로 미지의 시료가 5개씩 있었는데 이들이 몇탄당인지 혹은 몇 차 단백질인지를 추측 할 수 있었다.

결과분석에 앞서 각 정성에 쓰이는 용법에 대해 조사해 보았다.

1) Benedict reaction

베네딕트 시약에 있는 황산구리는 알칼리와 반응하여 Cu2(OH)2가 되고 이것이 환원당에 의해 환원되면 적갈색의 산화구리로 변한다.

 

2) Barfoed reaction

바포드 시약은 약한 산성이기 때문에 2분 정도 짧은 시간의 가열로는 단당류에 의해서만 Cu이온이 환원되어지므로 단당류와 이당류를 구분할 수 있다. 그러나 이당류는 이 시약과 오래 끓이면 가수분해되어 양성반응을 나타내므로 처리시간이 중요하다.

 

3) Iodine reaction

요오드는 다당류에 흡착되어 착색물질을 만든다. 녹말은 청남색을 나타내고 글리코겐 및 녹말의 부분적 가수분해물인 덱스트린은 적갈색 내지는 갈색으로 음성반응을 나타낸다.

 

4) Sucrose reaction

수크로오스는 비환원성 이당류이므로 알칼리성 황산구리용액을 환원시키지 않는다. 그러나 수크로오스를 산으로 가수분해하면 glucose와 fructose의 혼합물이 얻어진다.

 

5) Ninhydrin reaction

닌히드린 반응은 아미노기를 가진 유기물을 검출에 흔히 사용되는 방법이다. 닌히드린은 강력한 산화제로서 아미노산을 산화하여 암모니아와 이산화탄소를 유리시키고 알데히드를 생성하여 자신은 환원된다. 유리된 암모니아는 환원된 닌히드린 및 잔류 닌히드린과 반응하여 자색의 발색 반응을 한다. 닌히드린 반응은 아미노기를 가진 유기물질 즉 단백질, 펩티드, 아미노산에 대해서 양성반응을 나타내며 또 암모니아에서도 양성 반응을 나타낸다.

6) Millon's reaction

단백질에 Millon 시약을 작용시키면 적갈색으로 된다. 이 발색반응은 페놀성 히드록시기를 가진 티로신에 기인하는 것이며, 티로신 자신은 물론, 페놀성 히드록시기를 가진 화합물들도 Millon 시약에 의해 양성반응을 나타낸다. 원래 Millon 시약으로는 50%(v/v) HNO3에 Hg(NO3)2를 녹인 것이 사용되었지만, 요즈음은 무기염의 존재하에서도 이 보다 더 예민하게 작용하는 개량된 시약이 쓰이고 있다.

 

7) Biuret reaction

기본적으로 뷰렛 반응은 펩티드 결합을 가지고 있는 화합물과 반응하여 발색한다. 뷰렛은 알칼리성 CuSO4와 반응하여 보라색 착화합물을 만든다. 두 개 이상의 펩티드 결합을 가진 화합물도 마찬가지로 유사한 착화합물을 만들며 단백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 이 원리를 이용하여 단백질을 검증하고 정량할 수 있다. 보통 이 방법으로는 약 1 - 10 mg 정도의 단백질을 정량할 수 있지만, 미량 뷰렛 방법은 약 0.25 - 2 mg 까지 정량할 수 있는 감도를 가진다. 착화합물의 색은 1 - 2시간 동안은 안정되지만, 그 이상의 시간에서는 점점 색도 증가한다.

뷰렛반응

8) Xanthoprotein reaction

단백질 용액 5ml에 c-HNO 2ml을 가하면 백색 또는 황색 침전물이 생기는데 이것을 가온하면 황색침전이 나타낸다. 이것을 방랭 시킨 뒤, NaOH 용액으로 이 용액을 알칼리성으로 만들면 등황색으로 변한다. 이것은 단백질 중의 tyrosine, tryptophan, phenylalanine 등의 방향족 아미노산이 nitro화 되어 정색되기 때문이다. 젤라틴은 방향족 아미노산을 포함하고 있지 않기 때문에 정색 반응을 일으키지 않는다.

 

실제 실험에서는 먼저 단백질의 정성을 먼저 진행하였다.

먼저 닌히드린반응을 먼저 실시하였는데 2번 시료만이 자색을 띄며 반응을 하였다. 따라서 2번의 시료는 아미노기를 가진 물질임을 알 수 있었다.

 

두 번째로, Millon's반응을 실시하였는데 1번 시료가 뿌연거품을 내며 반응이 일어났는데 이를 통해 페놀구조를 가진 물질은 1번 시료임을 알 수 있었다. 이 결과를 토대로 보면 1번시료가 닌히드린반응에서 반응을 하지 않았는데도 Millon's반응에서 반응올 보였기에 실험이 어느 하나가 잘못 됬음을 알 수 있었다. 너무 실험을 빠르게 진행하다 보니 시료를 pipeting하는 중에 실수를 범한 것이라 사료된다.

세 번째로는 Biuret반응인데, 1번과 5번시료가 반응을 보였다. 따라서 1번과 5번 시료가 tripolypeptide이상의 다당류로 구성되 있음을 알 수 있었다.

마지막으로 Xanthoprotein reaction에서는 1번과 4번이 반응을 하였다. 따라서 1번과 4번이 벤젠고리를 갖고 있음을 알 수 있었다. 어떠한 반응 실험에서도 반응이 일어나지 않은 3번 시료는 단백질이 아님을 알 수 있었다.

 

이후 탄수화물 정성을 실시하였다.

첫 번째로는 benedict reaction인데 1번과 4번이 반응을 하였다. 따라서 1,4번이 환원당이고 나머지는 비환원당 임을 알 수 있었다.

여기서 환원당이란 알데하이드기나 케톤기를 가지고 있으며 알칼리성 용액에서 Cu, Ag, Fe 이온 들을 환원시켜 당류의 종류에 따라 여러 가지 빛깔의 침전물을 생산한다. 단당류는 분자 내에 알데히드 또는 케톤기를 하나 가지고 있는 탄수화물로 탄소 수에 따라 6탄당, 5탄당 등으로 불린다. 6탄당에 속하는 당류에는 포도당, 과당 등이 있으며 5탄당으로는 리보오스, 데옥시리보오스 등이 있다. 이당류는 단당류 2분자가 글라이코시드로 연결된 당이며 이에 속하는 것으로는 설탕, 말토오스, 젖당 등이 있다. 즉, 이를 통해 반응한 2,5번은 단당류 혹은 이당류임을 알 수 있다.

 

두 번째 실험은 barfoed reaction으로 첫 번째 Benedict reaction에서 반응한 시료들만 확인하였고 짧은 시간 가열하 였을 때에는 1번 시료가 반응하였다. 따라서 1번 시료는 단당류라고 추측할 수 있다. 참고로 4번 시료도 오랜 시간(15분 정도)가열 하면 침전물이 생긴다고 하나 시간관계상 시도는 해보지 않았다.

 

세 번째 반응은 Iodine reaction으로 요오드-요오드화 칼륨으로 다당류를 구분해 내는 실험으로 요오드는 다당류에 흡착되어 착색물질을 만든다. 녹말의 경우 청남색을 나타내고 글리코겐 및 녹말의 부분적 가수분해물인 덱스트린은 적색 또는 갈색으로 음성반응을 보인다. 실험 결과로 보아 3번 시료가 청남색을 보여 녹말임을 추측할 수 있었다.

 

네 번째 반응은 Sucrose reaction으로 수크로오스를 구분해 내는 방법이다. 수크로오스는 비환원성 이당류이므로 알칼리성 황산구리용액을 환원시키지 않는다. 그러나 수크로오스를 산으로 가수분해하면 글루코오스와 후루코오스의 혼합물이 얻어진다. 그러므로 이 실험에서 HCl을 이용해 수크로오스를 가수분해하고 NaOH를 10방울 정도를 떨어뜨려 중화시켜 준 결과 2번에서 반응이 일어남을 확인 하였다. 따라서 2번 시료가 수크로오스이고 아무것도 반응하지 않은 시료인 5번은 탄수화물이 아님을 알 수 있었다.(D.W.임을 알게 되었다.)

 

탄수화물 정성의 경우 원리에 대해 조금 더 생각해보고 실험을 진행하였기 때문에 쉽게 결과를 낼 수 있었지만 단백질 정성은 실험을 빠르게 하려다 보니 이해를 하지 못한 부분도 많았고 결과도 자세히 판별할 수 없었던 것 같다. pippet의 사용도 익숙하지 못해서 정확한 양을 넣지 못한 점과 짧은 시간에 시료를 옮기는 과정에서 헛갈려 시료를 잘못 넣었거나 엉뚱한 반응제를 넣었을 가능성이 이번 결과에 영향을 미쳤다고 생각된다. 다음부터는 여유를 갖고 실험에 임하도록 하여야겠다.

참고 문헌

1. 탄수화물 정성 실험

1) 개정 생물학 실험, 지구문화사, 대한생물교재 편찬 위원회, 2000, p.61-63

2) 유기화학, 자유아카데미(제4개정판), P.J Fessenden 외 1명, 1990, p.9-12

3) 분석화학, 자유아카데미, 정기호, 1997, p.69~76

 

2. 단백질 정성

1) 생화학, 양서각, 안용근, 강철호, 1997, p.135-160

2) 생물화학실험, 형설출판사, 하정욱, 2003, p.124-125

3) 기초화학, 영문사, Larry Gschere, p.29~38

4) 일반생물학실험, 형설출판사, 곽대모 외 9명, 1995, p.79~80

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