[생화학실험]Micro-Capilary electrophoresis(모세관 전기영동법)

실험 목적

추출된 DNA의 크기와 농도를 측정한다.

 

실험 이론 및 원리

1. 전기영동

많은 분자들은 수용액에서 +전하나 -전하를 띄고 있는데 이 때 외부에서 전기장을 걸어주면 각 이온들은 반대 전하를 띈 전극으로 이동하게 된다. 이를 이용하여 혼합물을 분리하여 분석하는 방법을 전기영동이라 한다. 증폭된 산물을 크기별로 분리하는 실험으로 증폭 산물을 음전극 쪽에 놓고 반대편을 양전극으로 하여 전류를 흘려주면 음전하를 띠고 있는 DNA분자가 양전극 쪽으로 끌려가게 된다. 

DNA는 겔을 통해 이동하는데 겔은 미세한 분자적 구멍이 있는 반고체 상태의 물질로 증폭 산물의 크기에 따라 이동 속도가 다르기 때문에 크기별로 분리할 수 있는 것이다. 이렇게 움직이는 속도를 이미 알고 있는 크기의 DNA와 비교하여 실제로 시료에서 증폭된 산물의 크기를 측정할 수 있게 된다.

 

2. 모세관 전기 영동법(Capillary electrophoresis ; CE)

전기장을 걸어주어 시료성분이 전하와 이동도에 따라 각각 일정한 방향과 속도로 이동하여 시료를 분리해내는 전기영동법을 모세관에 적용시켜 물질을 분리하는 것이다. 아주 가느다란 관, 즉 모세관에서 수행되는 방법으로 실리카로 된 모세관은 길이가 약 20～30 cm이고 지름(두께)은 약 50～100 ㎛정도가 된다. 

전기영동을 수행하는 시간은 10～20 분이다. 모세관의 전기저항이 높기 때문에 최소한의 열을 발생시키면서 높은 전기장(100 ∼ 500V/cm)을 걸어줄 수 있고, 표면적 대 부피의 비가 크기 때문에 발생되는 열을 효과적으로 발산시킬 수 있다. 또한 높은 전기장을 걸어주게 되면 결과적으로 분석 시간이 짧아지고 효율과 분리도도 높아지게 된다. 이러한 전기삼투적 흐름은 전하에 관계없이 모든 용질을 동시에 분석할 수 있다. 또한 CE는 다양한 분리 모드를 이용하여 선택성을 조절할 수 있고 적은 양의 시료(1∼10nl)소모, 모세관 직접 검출(On-capillary Detection), 정량 분석 및 자동화의 가능성으로 인하여 급속도로 발전하고 있는 분리 기술이다.

그림 1. Capillary Electrophoresis System 개념도

CE기능에서 중심적인 역할을 하는 것은 전기 삼투 또는 전기 삼투적 흐름이다. EOF는 캐필러리내의 액체의 흐름으로 이는 캐필러리내벽의 표면전하로 인하여 나타나는 현상이다. EOF는 캐필러리내벽면에 두 층으로 된 용액에 전기장을 가함으로써 생긴다. 용질이 캐필러리내에 머무르는 시간은 그 용질의 이동도 뿐만 아니라 EOF에도 의존하므로 EOF를 변화시키면 용질의 머무르는 시간을 조절할 수 있다. 그러나 EOF가 선택성에 영향을 미치지는 않는다.

수용액에서 대부분의 고체 표면은 과량의 음전하를 띠고 있다. 이것은 표면이 이온화(즉, 산-염기 평형)되고 표면에 이온성 물질이 흡착한 결과이다. EOF는 음이온 형태(SiO-)로 존재가능한 실란올기(SiOH)에 의해서 주로 조절되지만(그림 2a) 용융 실리카의 경우에는 위의 두 가지 과정이 모두 다 일어날 수 있다. 용융 실리카의 정확한 등전점(isoelectric point; pI)은 결정하기 어려우나, pH 4 이상에서는 EOF가 커진다. 테프론과 같은 비이온성 물질도 EOF를 나타내는데 이는 음이온의 흡착으로 인한 결과라고 예측된다.

전하를 중성화시키기 위해서 짝이온(주로 양이온)이 표면 가까이에 모여 들면 이중층이 형성되고 내벽 근처에서 전위차가 생기는데 이를 zeta 전위하고 한다(그림 2b). 캐필러리에 전압을 걸어주면 확산 이중층을 형성하는 양이온은 음극으로 끌리게 된다. 이때 이 양이온은 용해된 상태이기 때문에 캐필러리내의 용액도 함께 음극으로 이동한다. 이 과정을 그림 2c에 나타내었다.

그림 2. 전기삼투적 흐름의 생성과정

a) 음으로 하전된 용융 실리카의 표면

b) 표면 근처에 모이는 수화된 양이온

c) 전기장을 걸어주었을 때 생기는 음극으로의 큰 흐름

zeta 전위는 캐필러리내벽의 표면 전하에 의하여 결정되고 이 전하는 pH에 크게 의존하므로 EOF의 크기는 pH에 따라 달라진다. pH가 높아 실란올기가 이온화되면 낮은 pH에서 이온화 되지 않을 때보다 EOF의 값은 더 커지게 된다. pH가 2와 12사이인 경우에는 주어진 조건에 따라 EOF의 값이 크게 변할 수 있다. 이중층 이론에 의하면 zeta 전위는 완충액의 이온 세기에도 의존한다. 이온 세기가 증가하면 이중층이 압축되어 zeta 전위가 감소하고 EOF의 값도 감소한다.

캐필러리내에서 EOF의 중요한 특징은 수직 흐름(flat flow)이다. 흐름을 일으키는 힘이 캐필러리의 내벽을 따라 균일하게 분포되어 있으므로 압력강하가 일어나지 않고 흐름은 전반적으로 균일하다. 수직 흐름인 경우는 용질 구역(solute zone)이 분산되지 않으므로 바람직하다. 반면에 외부 펌프에 의해서 생성된 흐름은 벽에서의 마찰력 때문에 층상 흐름(laminar flow)이나 포물선 흐름(parabolic flow)을 나타낸다.

EOF의 또 다른 잇점은 전하에 관계없이 모든 성분이 같은 방향으로 이동한다는 것이다. 정상 조건 하에서(즉, 캐필러리의 표면이 음으로 하전된 상태) 흐름은 양극에서 음극으로 향한다. 음이온도 음극으로 흐르게 되는데 이는 EOF의 크기가 음이온의 전기영동적 이동도보다 월등히 크기 때문이다. 이렇게 모두 같은 방향으로 이동하므로 양이온, 중성 물질, 음이온이 모두 한꺼번에 분리될 수 있다. 양이온인 경우 가장 빠른 속도로 이동하는데 이는 양이온의 전기적 이동방향과 EOF의 방향이 동일하기 때문이다. 중성 물질인 경우는 전기적 이동에 의해서가 아니라 모두 EOF와 함께 용리되기 때문에 각각의 성분이 서로 분리되지 않는다. 음이온은 EOF의 반대방향인 양극으로 끌리므로 가장 느린 속도로 이동하지만 결국에는 월등히 큰 EOF에 의해서 음극으로 향하게 된다.

 

3. 모세관 전기이동 시스템

모세관은 완충용액으로 채워져 양끝이 완충용액 유리병에 담겨져 있고 이 완충용액 유리병에는 고전압 전원에 연결된 전극이 담겨져 있다. 전기장은 높은 전압을 걸어 줌으로써 생기고 이 때 전압은 30kV까지 걸어 줄 수 있다. 시료의 주입은 모세관의 한쪽에 담긴 완충용액대신 시료 vial을 담그고 압력을 주거나 전기장을 걸어주어 주입시킨다. 시료성분의 검출은 시료를 주입시킨 반대편 모세관 끝부분에 검출기를 두어 측정한다.

 

4. 모세관 전기영동의 원리

CE는 적당한 전해질 완충용액이 채워진 모세관의 양 끝이 완충용액에 담겨있고 고전압을 이용하여 모세관 양 끝에 전장을 걸어준다. 전하를 띈 용질이 완충액을 통과하여 나오는 것을 모세관의 끝(음극)에 있는 검출기에서 감지하게 된다. 모세관에서 이온을 띈 물질이 분리되어지는데 기여하는 유체의 움직임이 2가지가 있다.

1) 전기이동적 흐름 ( Electrophoretic flow )

전하를 띈 용질이 반대 전하 전극으로 이동하는것을 말한다. 이 때의 이동 속도는

υe = μe×E = (μe×V)/L

로 나타내며, 여기서 υe는 전기이동 속도, μe는 전기이동도, E는 전기장, V는 걸린전압, L은 모세관 길이이다. 용질의 분리는 서로 다른 속도로 모세관을 이동함으로써 생기는데 이때, 전기이동도(μe)는

μe = q/6πηr

로 나타내고 q는 이온화된 용질의 전하, η는 완충용액의 점도, r은 이온의 반경이다. 이 식으로부터 크기가 작고 큰 하전을 띤 용질이, 크기가 크고 작은 하전을 띤 용질보다 빨리 이동함을 알 수 있다.

 

2) 전기삼투적 흐름 (Electroosmotic flow)

유체가 항상 일정한 방향으로 움직이게 하는 힘이다. 모세관내의 큰 흐름으로 모세관 내벽 표면전하 때문에 생긴다. 전기삼투 흐름의 특징은 평면 흐름으로 이것은 용질 구역이 분산되지 않으므로 띠넓힘 현상이 적어 높은 분리능을 가지는데 중요한 역할을 한다. 전기삼투 흐름을 측정하는 가장 간단한 방법은 하전을 띄지 않은 화합물인 중성화합물을 주입하는 것이다.

 

5. 검출 방법

Method	Mass detection limit(mol)	conc. detection limit	장 단점
자외-가시광 흡수법	10-13～10-16	10-5～10-8	DAD를 이용해 스펙트럼에 관한 정보를 얻을 수 있다. 널리 사용
형광검출법	10-15～10-17	10-7～10-9	감도가 좋다. 시료를 유도체화
레이저유도 형광검출법	10-18～10-20	10-14～10-16	감도가 매우 좋다. 시료를 유도체화. 가격이 비싸다.
전류법	10-18～10-19	10-10～10-11	감도가 좋다. 전기활성시료에만 유용, 특수한 전자장치가 필요
전도도법	10-15～10-16	10-7～10-8	널리 사용된다. 특수한 전자장치가 필요, 모세관을 변형
질량분석법	10-16～10-17	10-8～10-9	감도가 좋고 시료의 구조에 관한 정보를 얻을 수 있다.
간접UV,형광,전류법	직접법에 비해 10～100배 감도가 낮다.		널리 사용된다. 다른 분석법에 비해 감도가 낮다.
그 밖의 방법 : 방사화법, 열렌즈, 굴절률, 원편광이색법, 라만분광법 등

 

1) 자외-가시광 흡수

자외-가시광흡수는 검출범위가 넓기 때문에 보편적인 검출특성을 가지고 있어서 가장 널리 사용되는 검출법이다. 용융실리카 모세관을 사용하면 200㎚ 미만에서부터 가시광선 영역의 빛을 모두 사용할 수 있다. HPCE의 효율이 높은 것은 모세관 직접 검출이 가능하여 불감부피나 각 성분의 혼합으로 인한 구역 넓어짐이 생기지 않기 때문이다.

 

2) 레이저 유도 형광검출기

레이저로 유도된 형광을 이용하는 검출기로 자외-가시부 검출기에 비해 100～1000배의 감도를 갖기 때문에 생체중의 미량성분 분석에 유리하다. CE에 있어서 형광검출기의 장점은 신호대 잡음비가 광로의 길이에 크게 영향을 받지 않는다는 사실이다. 이 검출기의 단점으로는 중요한 생체물질중의 상당수가 형광이 없거나 약하다는 것인데 이런 경우에는 시료를 형광을 내는 다른 물질과 반응시킨 후에 분석한다.

 

6. 실험 용어

1) 겔

이 현상을 겔화라 한다. 한천(寒天) ·두부 ·실리카겔 등이 그 예이다. 이들은 콜로이드입자의 그물조직 사이에 용매인 물 등이 들어가 굳어버린 것이며, 다시 온도를 올려 주면 분자운동이나 그 밖의 원인에 의하여 조직이 파괴되어 다시 유동성 액체로 된다. 그물조직 사이에 물이 들어 있는 겔을 히드로겔이라고 하며, 겔의 그물조직 사이에서 용매가 제거되고 공기가 들어간 모양의 다공성(多孔性) 겔을 크세로겔이라고 한다.

 

2) 모세관

모세관 현상을 나타내기에 충분할 정도로 가는 관을 말한다. 그러나 특별히 정해진 반지름 또는 반지름의 한계는 없고, 또 관의 길이와 형상에 대해서는 아무것도 지정된 것이 없기 때문에 하나의 가늘고 긴 관의 경우도 있지만 다공체 또는 분체 간극과 같이 비교적 짧은 불규칙한 가는 관의 집합체인 경우도 있다. 모세관의 안지름의 크기는 여러 종류의 조건으로 정해지기 때문에 일괄적으로 규정할 수 없지만 공기와 물, 수용액, 수은 등의 기액(氣液) 평형계에서는 1mm 이하의 경우를 가리키는 것이 보통이다.

 

3) 전기 삼투

격막으로 칸막이한 용기(전해조) 속에 액을 넣고 전극간에 직류 전압을 가할 때에 격막을 통해 액이 이동하는 현상. 1808년 러시아의 F.F. Reuss가 처음 발견하였다. 전기 삼투의 기구에 대해서는 격막의 가는 구멍 속에 존재하는 전기 이중층 중 전기장하에서 움직일 수 있는 전하가 이동하고 이 전하가 액을 수반하기 때문에 일어나는 것이라고 생각되고 있다. 따라서, 전기 이중층의 구조에 관한 지식을 주는 ζ전위의 부호에 의해 액의 이동 방향은 변화한다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구
Agilent 2100 Bioanalyzer, Chip Priming Station, Vortex mixer
 
2. 실험 시약
PCR products, Agilent DNA 7500 LabChip Kit, DNA Chips(25 DNA Chips, 1 Electrode Cleaner)

실험 방법

1. 실험 과정
1) DNA Dye Concentrate와 DNA Gel Matrix를 상온에서 30분동안 안정화시킨다.

2) 1.5㎖ micro-centrifuge tube에 DNA Gel Matrix 400㎖와 DNA Dye Concentrate를 20㎖를 넣고 voltexing한다. Dye concentrate는 4℃에서 알미늄호일로 감싸 빛을 차단하 여 보관한다.

3) Gel-dye mix를 spin down 한 후에 Spin Filters에 옮겨 담고 5000rpm에서 10분동안 원심분리한다.