[미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 5부

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험은 미생물의 생화학적 검사를 통하여 미지의 세균을 분리하는 실험으로 Staphylococcus spp. 중 무엇인지 알아보았다. 우리는 이번 실험 시간에 총 13가지의 실험방법을 터득해 보았다.

먼저, 당분해 실험을 해 보았는데 우리는 glucose와 mannitol이 들어간 배지를 이용하였다. 세균은 호기적 조건에서 glucose 및 다른 당을 이용하여 결국은 mixed acids를 생성하기도 하고, 혐기적 조건에서 산 발효 경로를 통해 lactic acid 등의 산을 생성해 낼 수 있고 알코올 발효경로를 통해 2,3-butanedol 등과 같은 알코올을 생성해 내기도 한다.

Introduction에 자세히, 그리고 결과에 간단히 언급했듯이 세균이 당을 이용하면 산이 생성되어 배지 내에 포함된 phenol red에 의해 배지가 황색으로 변하게 된다.

실험결과에서 glucose와 mannitol 배지 색깔이 모두 적색에서 황색으로 변하는 걸 볼 수 있었는데 이는 이 세균이 glucose와 mannitol을 모두 이용하기 때문이라 할 수 있다. 이 경우에는 산을 생성하는 산 발효 경로를 거쳐 glucose와 mannitol을 이용하였다.

실험 시 우리는 Durham tube를 삽입하지 않았기 때문에 gas(CO2)생성여부를 관찰 할 수는 없었다.

두 번째로 catalase test를 해보았다. Catalase는 H2O와 O2를 생성한다. 우리는 세균을 묻힌 슬라이드 위에 H2O2를 떨어뜨려서 기포(O2)가 형성되는지를 관찰함으로써 catalase의 여부를 알아보았다. 우리는 기포가 형성되는 걸 관찰할 수 있었고, 이 세균은 catalase를 가지고 있다는 걸 알아냈다.

세 번째로 oxidase test를 해보았는데, 우리는 실험 시 dimethyl-p-phenelyenediamine이란 시약을 통해 색깔 반응을 살펴보았다. 이 시약은 원래 무색으로 oxidase에 의해 산화되어 푸른색이 되어 푸른색의 결과가 나오면 양성인 것이다. 실험결과, 여과지는 푸른색으로 변하지 않아 이 세균은 oxidase를 가지지 않음을 알 수 있었다.

네 번째로 arginine decarboxylase test를 해보았는데 아직 결과를 얻지 못하였다. 더 배양해 본 뒤 알아보기로 하였다.

참고로 arginine의 분해 여부를 알아보는데 arginine첨가 배지와 arginine을 첨가하지 않은 배지를 가지고 비교하는 이유는 다음과 같다. Arginine을 첨가한 배지에는 arginine과 glucose가, 그렇지 않은 배지에는 glucose만 들어 있는데, 이를 비교하는 이유는 이 세균이 arginine을 이용하는지 안 하는지 그리고 glucose만을 이용하는지 또는 둘 다 이용하는지를 비교하기 때문이다. 즉, arginine만 이용하면 arginine 첨가배지는 짙은 자색이 되고, control(arginine 첨가 안 한 배지)은 색깔변화가 없겠고, arginine과 glucose를 둘 다 이용하는 경우에는 arginine첨가배지는 황색을 띄는 혼탁한 자색이, control은 황색으로 나타난다(arginine이 없고 glucose만 있으므로). 만약 둘 다 이용하지 못하는 경우에는 색깔 변화가 없고, arginine을 이용하지 못하고 glucose만 이용한다면 두 배지 모두 황색을 띨 것이다.

다섯 번째로 DNase test 결과는 양성으로 나타났다. DNase agar에 균을 접종 후 배양시켜 1N HCl을 가해 colonies 주위의 투명성 여부를 관찰해 보았는데 colonies 주위가 투명한 것이 DNase에 의해 DNA가 분해된 것이다. 이 세균의 경우에는 colonies 주위가 투명한 것으로 미루어 DNase를 가져 DNA를 분해 할 수 있다.

여섯 번째로 용혈성을 관찰해보았는데, 혈액배지에서 자란 colony 주위가 투명한 걸로 보아 완전용혈, 즉 β용혈성을 가짐을 알 수 있었다. 이 세균은 병원성이 있을 걸로 추정된다.

일곱 번째로 SIM배지를 이용하여 운동성과 생성여부를 알아보았는데, 결과는 둘 다 음성으로 나왔다. 이 세균은 편모나 섬모가 없는 것으로 생각된다.

H2S gas가 생성되면 배지의 iron과 gas가 complex를 이루어 검은색 complex가 관찰되어야 한다. SIM 배지에서 H2S를 생성한다는 것은 균이 황이 포함된 아미노산을 분해할 수 있다는 얘기다.

여덟 번째로 NaCl test를 해보았는데, 10% NaCl에서는 세균이 생존했고, 15% NaCl에서는 세균이 죽었다. 이 세균은 어느 정도 염에 저항성이 있다.

아홉 번째로 esculin hydrolase test를 해보았는데 그 결과 음성으로 나타났다. 만약 세균이 esculin을 분해하여 esculetin과 glucose가 생성되면 esculetin이 배지의 iron과 결합하여 검은 색 화합물을 만들게 되나 이 균을 배양시킨 배지에서는 그러한 화합물이 관찰되지 않았다. 이 균은 esculin hydrolase가 없기 때문에 esculin을 이용하지 못한다.

마지막으로 VP test를 해봄으로써 이 세균의 2,3-butanediol 생성여부를 알아보았는데 실험결과는 음성으로 나왔다.

☞ 모든 결과를 종합하여 본 세균분리동정 표와 비교했을 때 가장 근접한 세균은 Staphylococcus aureus로 미지의 세균은 Staphylococcus aureus라 결론내렸다.

실제로 생화학적 검사 결과와 분리동정표가 100% 맞기란 어렵다. 따라서 80～90% 일치하면 그 세균이라 결론 내린다고 한다.

실제 우리가 사용했던 균은 Staphylococcus aureus라고 했다.

미지의 균으로 사용한 Staphylococcus aureus는 Staphylococcus 속으로 Staphylococcus의 일반적 특징은 다음과 같다.

▶ 그람양성균, 불규칙적인 포도송이처럼 배열, 각종 배지에서 쉽게 발육

▶ 백색에서 짙은 황색에 이르는 색소 생산

▶ 병원성이 있음: 용혈 작용, 혈장 응고 작용

▶ spore를 형성하지 않은, catalase strongly positive, nonencapsulated

▶ 운동성 없음, oxidase negative

▶ 많은 탄수화물을 발효시킴: OF : fermentation

그러면 실험결과와 실제 Staphylococcus aureus의 생화학적 특성을 비교해보도록 하겠다.

		실험결과	실제 특성
Glucose 배지		Acid	Acid
Mannitol 배지		Acid	Acid
Oxidase test		-	-
Catalase test		+	+
Arginine decarboxylase test		결과 없음	+
DNase test		+	+
용혈성		완전용혈(β)	완전용혈(β)
운동성		-	-
H2S 생성여부		-	+
NaCl test	10%	Growth	Growth
	15%	Nongrowth	Growth
Esculin hydrolase test		-	-
VP test		-	+

 

▶ Glucose 및 mannitol 배지에서 세균을 키웠을 때 배지의 색이 황색으로 변하는 것으로 미루어 S. aureus는 산 발효경로를 취하여 당을 분해함을 알 수 있었다.

▶ VP test 결과는 음성이었으나 실제로는 양성반응이 나와야 한다. VP test가 양성이란는 말은 S. aureus가 알코올 발효 경로를 취해 당을 발효시킨다는 의미이다.

▷ 위의 두 가지 test는 S. aureus가 산소가 부족한 조건에서 산 발효 경로와 알코올 발효 경로를 통해 당을 분해한다는 것을 나나내어 준다.

▶ Catalase test의 경우 세균을 묻힌 슬라이드 위에 H2O2를 떨어뜨리자 기포(O2)가 형성된 것으로 미루어 S. aureus는 catalase를 가지고 있다는 걸 알 수 있었다.

▶ Oxidase test 결과는 음성으로 S. aureus는 oxidase의 활성이 없음을 알 수 있었다.

그런데 한 가지 의문사항이 있다. S. aureus는 그람양성균으로 대부분의 그람양성균은 oxidase를 가지고 있는 것으로 알려져 있다(S. aureus도 마찬가지). S. aureus는 호기성 및 혐기성에서 살 수 있는 통성 혐기성균으로 알고 있는데, 전자전달계(호기성 조건 시 에너지 생산경로)와 관련 있는 oxidase가 왜 없는지에 대한 의문점이 생겼다.

▶ Arginine decarboxylase test의 결과는 좀 더 배양해 본 뒤 알아보기로 하였는데 이론에 따르면 S. aureus는 양성반응을 나타낸다. 또한 이 균은 glucose 발효능이 있었으므로 arginine이 첨가된 배지 내의 arginine과 glucose를 모두 분해하여 배지의 색깔은 arginine첨가배지는 황색을 띄는 혼탁한 자색이, control은 황색으로 나타날 것으로 생각된다.

▶ DNase test 결과는 양성으로 S. aureus는 DNase를 가져 DNA를 분해 할 수 있다.

▶ S. aureus를 혈액배지에서 키웠을 때 colony 주위가 투명한 걸로 보아 완전용혈, 즉 β용혈성을 가짐을 알 수 있었고 병원성이 있을 걸로 추정된다. 실제 S. aureus는 병원성을 가진다.

▶ SIM배지를 이용하여 운동성 여부를 알아 본 결과 음성으로 실제로 S. aureus는 운동성이 없고 이 세균은 편모나 섬모가 없는 것으로 생각된다.

▶ 같은 SIM배지를 이용하여 H2S생성능력의 여부를 알아 본 결과 음성으로 나왔는데 실제 S. aureus는 H2S gas를 생성 할 수 있고, 이는 균이 황이 포함된 아미노산을 분해할 수 있다는 얘기다.

▶ NaCl test결과, 10% NaCl에서는 세균이 성장했고, 15% NaCl에서는 세균이 죽었다. 실제로 이 세균은 10%, 15% NaCl에서 모두 생존 할 수 있다. 즉, 염에 저항성이 있다.

▶ Esculin hydrolase test의 결과는 음성으로 S. aureus는 esculin hydrolase가 없기 때문에 esculin을 이용하지 못한다.

 

참고 문헌

1. 신현성․이규식, 2000, 일반미생물학, 개정판, 형설출판사, 서울, P. 586～ 598

2. 한국미생물학회, 1998, 미생물학 실험서, 1st, 을유문화사, 서울 P. 106, 107, 119～124

3. 박석기 외, 1997, 최신미생물학, 1st, 신광문화사, 서울, P. 371～378

4. Cappuccino, 2005, Microbiology, 7th, PEARSON, San Francisco, P 151～154, 197～199

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 1부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 2부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 3부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 4부