[미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 2부






실험 이론 및 원리 - 2


5. DNase 시험 (deoxyribonuclease test)

(1) 실험 목적

세균이 DNA 분해효소인 DNase의 생성여부를 검사하는 것이다.

 

(2) 실험 원리 및 방법, 결과

DNA를 첨가한 배지에 균을 접종한 후 그 반응을 검사하는 데 배지에 따라 반응을 보면

① 표준 산성 DTA 배지(standard acid DNase test agar (DTA) medium)의 획선배양 후 1N HCl을 집락 주위에 떨어뜨려서 집락 주위에 투명한 곳이 생기면 양성, 혼탁 되면 음성이다.


② 표준 산성 mannitol-DTA 배지(standard acid mannitol DTA medium) 양성은 집락 주위가 산성이므로 황색이 된다. 음성은 적황색(redish-orange)의 배지색깔로 변화 없다.


③ Toluidine blue O-DTA 배지의 양성은 세균 접종부위가 분홍색(rose pink zone)이고, 음성은 색의 변화 없이 맑은 청색이다.


④ Methyl green DTA 배지 양성은 녹색배지에 세균접종 부위가 선명한 곳(clear zone)을 흰 배경에서 가장 좋게 관찰된다. 음성은 녹색의 배지 색이다.


          효소                         효소

DNA ----------> nucleotides ----------> nucleosides + Pi

           H2O      base-sugar-   H2O     base-sugar    inorganic

                       phosphate                 complex       phosphorous

                       comp1ex                  (B-S)              (phosphate)

                       (B-S-P)

 

(3) 양성균 및 음성균

① 양성균: S. aureus, Serratia 등

② 음성균: 표피 포도구균, Klebsiella, Enterobacter 균종들


(4) 참조

DNA분해효소의 작용은 37℃ 이외 25℃, 30℃에서 검출이 용이하므로 조절이 필요하다.

 

6. bile esculin(aesculin) 시험

(1) 실험 목적

Esculin이 10～40% 담즙(bile) 존재 하에서 esculetin(aesculetin)과 포도당으로 가수분해되는가를 보는 시험이다.

 

(2) 실험 원리

Esculin 가수분해는 세균의 esculinase에 의해 6,7-dihydroxycoumarin과 6-β-glucosido-7-hydroxycoumarin의 연결부위를 절단함으로써 esculetin과 포도당이 생성되며, esculetin은 철성분(Fe3+)과 결합해서 검은색의 석탄산 철 화합물(phenolic iron complex)을 형성하는 특성을 가지고 있다.


                             산(Acid)

esculin(C15H16O9) -----------> esculetin(aesculetin) + β-D-glucose ①

6-β-glucosido-        가수분해   6,7-dihydroxycoumarin

7-hydroxycoumarin

 

 

esculetin + ferric ions(Fe3+) -------> phenolic iron 복합물질 (검은 갈색) ② 

 

(3) 결과 확인

Esculin 가수분해를 확인하는 방법으로는 40% bile이 첨가된 esculin 배지에서의 색 변화를 관찰하거나 esculin 분해산물인 포도당의 발효로 인한 pH감소를 측정하는 방법 또는 esculin이 가수분해 될 때의 형광소실을 확인하는 spot esculin 가수분해법과 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside를 기질로 이용하여 esculinase를 측정하는 방법이 있다.

 

(4) 이용 및 양성균

기타 연쇄구균 또는 D군이 아닌 연쇄구균에서 D군 연쇄구균 감별에 이용된다. 또한 Listeria monocytogenes는 양성이다.


7. 적혈구에 대한 용혈 (hemolysis)

혈액 한천배지상에서 적혈구에 대한 용혈상태로 α, β, γ용혈을 관찰할 수 있다.

① α용혈 : 폐렴 구균이나 viridans군의 α용혈성 연쇄구균(Streptococcus salivarius, S. sanguis, S. mitis)에서 집락 주위가 녹색대(green zone)을 나타내는 부분용혈 (partial hemolysis)을 볼 수 있다.


② β용혈 : β용혈성 연쇄구균(β-hemolytic streptococci group ABC등)에서 볼 수 있고 집락 주위는 적혈구의 완전용혈(complete hemolysis)에 의하여 투명한 용혈대를 볼 수 있다.


③ γ용혈 : γ용혈은 용혈이 없는 상태를 말한다.


④ 기타 포도상 구균에서 α, β, γ, δ의 용혈소를 나타낸다.

 

8. 운동성(motility) 판별

① 반고체 배지 (semisolid medium) - 본 실험

주로 Gram 음성 간균 중 장내 세균의 운동성 감별에 agar를 0.3～0.5% 첨가한 반고체 배지(semisolid medium)를 사용하며, 근자에 다목적 성상을 갖는 SIM, OIM, LIM배지상에서 배지가 혼탁되었을 때 운동성이 있고, 천자부분만 균이 자라면 운동성이 없는 것으로 균감별에 이용된다.


② 현적 표본 (hanging drop)

a. Cover glass 네 모퉁이에 waseline을 조금씩 바른다.

b. Cover glass 중앙부에 균부유액을 1 방울 놓는다.

c. 오목 파여진 slide g1ass(hole slide glass) 중앙의 홈부분이 균액이 있는 중앙에 오게 덮고서 즉시 뒤로 젖혀 100배～400배로 관찰하면 고유운동을 볼 수 있다. 이와 같이 hole slide glass 위의 cover glass의 균부유액이 매달린 상태로 관찰되므로 현적표본(hanging drop preparation)이라고 부른다. 배양시간이 오래되지 않은(18시간 이내) 것이 운동성이 좋다.



③ 편모 또는 섬모

편모는 미생물에 있어 중요한 운동기관이다. 그러므로 편모의 유무는 세균분류와 동정에 중요하고, 아울러 편모가 있으면 부착상태로 단모성, 양모성, 총모성, 주모성인지를 확인하여야 한다. 아울러 섬모도 하나의 운동기관이다.


9. 황화수소 (hydrogensuleide, H2S)

유황(Sulfide)을 포함하고 있는 amino acid인 methionine, cysteine 또는 sodium thiosulfate, sodium sulfate에서 효소의 작용에 의하여 무색의 H2S gas를 유리시키고 이것이 다시 철(iron)과 결합하여 검은색 침전을 볼 수 있다. 배지로써는 TSI(triple sugar iron agar), KIA(kligler iron agar), SIM(sulfide indole motility) 등 배지에서 H2S 생성으로 검은색을 볼 수 있다. 또한 lead acetate를 여과지에 적시고 H2S생성배지 위에 매달아 두면 H2S와 납(Pb)이 결합하여 PbS의 검은 침전을 볼 수 있다.

Proteus miradilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Bacteroides oralis 등은 H2S가 양성이다.


                     cysteine desulfurase

◈ cysteine + H2O ----------------> pyruvic acid + hydrogensufide gas + ammonia

 

 

                                    thiosulfate

◈ 4H+ + 4 e + 3S2O3 ---------------------> 2SO32- + 2H2S+ ①

                    thiosulfate       reductase  sulfite hydrogen  sulfide gas

  

hydrogen sulfide gas + ferric ions ----------> ferrous sulfide ②

 

◈ Pb(C2H3O2)2․3H2O + H2S ---------> PbS↓+ H2O + AC-

    lead acetate             hydrogen      lead sulfide       acetate

                                  sulfide gas


10. NaCl test

염에 대한 저항성을 알아보기 위한 실험으로 broth 배지에 NaCl을 x% 첨가한다. 만약 균이 염에 의해 죽지 않고 살아 성장한다면 배지가 뿌옇게 흐려진다.

 

11. voges-proskauer 반응 (VP reaction)

(1) 실험 목적

세균이 포도당을 발효시켜 유기산인 acetylmeyhylcarbinol(acetoin) 및 2,3-butanediol을 생성하는지의 여부를 알아보기 위함이다.

 

(2) 실험 원리

MR test가 음성이라는 것은 그 미생물이 포도당을 발효시켜 acid 대신 많은 양의2,3-butandiol과 ethanol을 생산한다는 의미이다(포도당 발효에는 산 발효와 알콜 발효가 있음).


현재까지 2,3-butanediol의 정성적인 측정을 할 수 있는 만족할만한 방법이 없으므로 2,3-butanediol의 전구물질인 acetoin을 간편한 방법으로 측정하는 것으로 대신하고 있다. Acetoin은 2,3-butanediol의 전구물질인 까닭에 항상 같은 양으로 존재한다고 볼 수 있다.


Voges-Proskauer 시험에 사용되는 시약은 alpha-naphtol과 KOH로 만드는 Barritt시약이다. 만약 배지에 포함된 포도당으로부터 acetoin이 생성되면 acetoin은 강알칼리에서 alpha-naphtol 촉매에 의해 산화되어 diacetyl 화합물이 된다. 또한 이 화합물은 배지에 존재하는 peptone이 알칼리상태에서 전환된 guanidine group과 반응하여 적색의 복합물을 이루게 된다.

          fermentation

glucose -------------> acetoin (acetyl methyl carbinol, AMC) ①


                              40% KOH

α-naphthol + acetoin -------------> diacetyl ②

(catalyst)                       O2

 

                                      condensation

diacetyl + guanidine nucleus -------------> pinkish-red color ③

(substrate present in peptone)


(3) 실험 방법

① MR-VP 배지에 각 세균을 접종한다.

② 37℃에서 24～48시간 배양한다.

③ 균 배양액에 Barritt 시약 A용액을 6방울 가하고, B용액 2방울을 가한 후 30초～1분간 흔들어 대기 중에서 산화시킨다.

④ 10～15분 방치한 후 결과를 판정한다.

 

(4) 실험 결과

① 양성: 배지가 적색(선명한 핑크)으로 변한다.

② 음성: 엷은 핑크 또는 황색

 

(5) 양성균 및 음성균

① 양성균: Enterobacter aerogenes, Klebsiella pnemoniae 등

② 음성균: E. coli, Shigella, Salmonella 등






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