[미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 1부

실험 목적

미생물의 생화학적 검사방법에 대해 알아보고, 검사방법을 통해 미지의 세균이 Staphylococcus spp. 중 무엇인지 알아본다.

 

실험 이론 및 원리

1. 당 발효 (Carbohydrate Fermentation)

(1) 실험 목적

세균은 다양한 종류의 탄수화물을 이용하는데 세균의 종류에 따라 이용가능한 탄수화물의 종류도 다르다. 따라서 특정미생물이 어떤 종류의 탄수화물을 이용할 수 있는가가 세균동정의 유용한 기준이 된다. 뿐만 아니라 탄수화물, 특히 당의 경로가 발효인지 호흡인지 또는 둘 다일 경우 어느 쪽이 우세한가 하는 것도 세균의 판정에 있어 중요한 기준으로 이용되고 있다.

발효현상을 알아보는 발효관의 하나인 Durham관을 이용하면 미생물의 발효에 의한 가스 발생의 유무를 확인 할 수 있으며, 발생되는 가스의 종류를 알아볼 때에는 Smith 발효관이라고 부르는 유리기구를 사용한다. 세균의 종류에 따른 당의 이용 과정과 양상이 어떻게 다른지 알 수 있다.

 

(2) 실험 원리

만일 미생물이 특정한 당을 발효시킬 수 있다면 산이 생성될 것이며 가스가 생성될 가능성도 있다. 산의 존재는 배지에 첨가시킨 지시약(phenol red)에 의한 색 변화로 알 수 있으며, 시험관 내에서 가스가 형성되면 시험관 내부에 거꾸로 집어넣은 Durham관내에 가스가 축적되므로 쉽게 관찰 할 수 있다.

 

(3) 실험에 쓰이는 배지 - 포도당만 예로

이 실험에 이용되는 배지는 포도당과 충분한 양의 beef extract, 그리고 peptone을 포함함으로써 대부분의 세균이 필요로 하는 질소원과 광물질이 충분히 들어 있다. 동시에 발효산물이 산성인가 중성인가 알칼리성인가를 알아보기 위하여 phenol red를 지시약으로 넣어주었는데, 이 phenol red는 pH가 7 이상일 때는 적색이고, 그 이하에서는 황색을 나타낸다.

 

(4) 일반적 실험방법 - 포도당만 예로

① 검정할 균을 glucose-phenol red broth 배지에 접종한다.

② 37℃에서 배양하되 16～24시간 후, 4～5일 후 두 차례에 걸쳐 다음 사항을 조사한다.

a. 색깔 변화: 즉, 산성화(노란색), 알칼리화(붉은색) 또는 중성(변화 없음)의 판정

b. 가스의 생성여부

c. 결론적으로 발효능이 우세한지, 호흡능이 우세한지 또는 양쪽이 다 가능한지를 확인

Detection of gas production

2. Catalase 생산

(1) 실험 목적

산소를 사용하는 대부분의 호기성 또는 혐기성 균들은 자신의 효소계에 저해한 과산화수소(H2O2)를 생산한다. 그러나 이러한 환경에서도 그들 자신의 생존이 가능한 것은 이들이 hydrogen peroxidase(과산화수소)를 물과 산소로 전환하는 catalase를 생산하기 때문이다. Catalase 생산력이 없거나 있다는 사실은 세균의 그룹에 있어서 매우 중요한 차별점이 된다. 이 실험에서는 이러한 catalase 생성능을 갖고 있는지의 여부를 검사하는 데 그 목적이 있다.

 

(2) 실험 원리

H2O2는 산소호흡에 의해 당이 분해될 때 생성되는 산화물로 환원형의 flavoprotein이 산소와 반응하여 생성되는 유독성 산물이다. 이와 같은 맹독성 H2O2를 물과 산소로 분해할 수 있는 catalase는 haem을 prosthetic group으로 가지고 있는 효소로서 cytochrome을 갖는 호기성 또는 대부분의 조건적 혐기성 세균에 존재한다. 때문에 catalase를 생산하는 통성혐기성 세균이나 호기성 세균에 H2O2가 물과 산소로 전환되므로 이 때 산소방울 즉, 기포를 관찰할 수 있게 된다.

 

(3) 실험 방법

A. 방법1

① 세균을 Soybean-casein digest agar(보통의 경우 NA배지도 가능)의 한천 사면배지에 접종 배양한다.

② 3% 과산화수소 1ml를 사면배양체에 가하고 가한 즉시, 또한 5분 후에 기포가 발생되는지 조사한다. 평판배지나 반고체배지에 배양한 경우에는 과산화수소 몇 방울을 균체 위에 가하여 관찰하고, 액체배양체는 배양액 0.5ml와 과산화수소 0.5ml를 가하여 관찰한다.

 

B. 방법2 - 실험시 사용한 방법

이 방법은 과산화수소가 평판 또는 사면배지상에 자란 균체로 스며드는 것을 방지하기 위한 방법.

① 검정균의 콜로니를 비금속성 기구로 채취하여 슬라이드에 미리 한 방울 가해 둔 과산화수소와 혼합하고, 혼합 즉시 그리고 5분 후에 기포 발생여부를 조사한다.

② 필요할 경우 저배율의 현미경으로 기포발생을 조사하기도 한다.

 

C. 방법 3

Haem이 든 배지에서 자랄 때만 catalase를 형성하는 세균을 검정하기 위한 방법

① Pseudocatalase의 형성을 막기 위해 1% 포도당을 가하여 멸균한 blood agar base (Soybean-casein digest)에 defibrinated blood와 멸균증류수를 동량 섞은 혼합액을 5%되게 만든다.

② 이 배지를 100℃에서 15분 끓여 blood 자체의 catalase를 불활성화시킨 다음 45～50℃로 식혀 멸균된 페트리 디쉬에 붓는다.

③ 배지를 응고 건조시킨 후 접종하고 배양하여 3% 과산화수소를 직접 콜로니에 처리하거나 방법 2와 같이 접종한다.

 

(4) 실험에서 예상되는 결과

방법1, 2, 3에 의한 결과를 판정함에 있어 과산화수소를 가한 즉시 기포가 발생하면 강한 양성반응, 5분 후에 발생하면 약한 양성 반응, 10분 후에 발생하거나 발생하지 않으면 음성반응으로 판정한다.

 

(5) 배지 이용하는 경우 주의사항

a. 혈액을 포함하는 배지는 혈액자체가 catalase 활성을 나타내므로 사용하지 말 것

b. Lactic acid 세균 종류는 포도당이 없거나 포도당 함량이 낮은 배지에서 nonhaem pseudocatalase를 만드는 것에 유의할 것. Pseudocatalase형성은 배지에 포도당을 1% 수준 가하면 억제된다. 혐기성세균을 검정할 때는 배양체를 약 30분 정도 공기에 접촉시킨 후 과산화수소를 가하도록 한다.

 

(6) Catalase를 가지고 있는/있지 않은 세균

a. 양성균 : Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Listeria monocytogenes, Corynebacterium 등

b. 음성균 : Streptococcus, Clostridium, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium haemolyticum, Erysipelothrix 등

3. Oxidase 생산

(1) 실험 목적

Oxidase 검정 실험은 주로 그람음성세균 중 호기성세균과 통성혐기성 세균을 구분하는데 그 목적이 있다. 환원형의 cytochrome이 전자전달계의 최종전달 수용체인 산소에 의하여 산화되는 과정을 촉매하는 효소인 cytochrome oxidase의 활성유무를 조사하는 방법이다.

 

(2) 실험 원리

Oxidase 검정 시약이 인위적 기질로 작용하여 oxidase system의 cytochrome C의 존재를 색 변화로 확인할 수 있게 해준다.

 

(3) 실험 방법

A. 방법1 - 실험 시 사용한 방법

① 여과지 조각에 oxidase 검정시약을 몇 방울 가하여 적신다(가끔 여과지가 청색으로 변하는 것이 있는데 이는 사용하지 말 것).

② 백금이 또는 유리봉(일반적으로 사용하는 니크롬선 제재는 절대 사용하지 말 것)으로 검정세균을 따서 ①번 과정에서 준비한 여과지 조각에 문지른다.

③ 10초 이내에 청색이 나타나면 양성이다.

 

B. 방법 2

방법 1보다 강도가 다소 덜한 방법이긴 하지만 편리하다.

① 검정균을 NA agar 배지 또는 broth 배지에 접종하고 배양한다.

② 95% 에탄올에 1%로 녹인 α-naphtol과 1% dimethyl-p-phenylenediamine oxalate수용액의 1:1 혼합액을 평판배지상의 콜로니에 몇 방울 가한다. 액체 배양체의 경우, α-naphtol 0.2㎖와 dimethyl-p-phenylenediamine oxalate 0.3㎖를 가하여 강하게 흔들어준다.

③ 10～30초 이내에 콜로니나 액체배양체가 짙은 청색으로 나타나면 양성이다.

 

(4) Oxidase시험에 사용되는 시약에 주된 2가지 형의 기전

     cytochrome C

① tetramethyl-p-phenylenediamine ----------> wurster’s blue

(wurster’s reagent)             oxidized O2 (ozone 또는 H2O2 존재 하에서 형성)

 

 

         oxidized O2

② dimethyl-p-phenylenediamine + α-naphthol ------------> indophenol blue

        cytochrome C (물에 불용성)

실험시에 dimethyl-p-phenylenediamine 사용

dimethyl-p-phenylenediamine

AH2 + 1/2 O2 -----------------------------> A + H2O

oxidase indophenol blue compound

☞ 무색의 dimethyl-p-phenylenediamine을 인위적 전자수용체로 사용하는데, 세균이 oxidase를 가지고 있으면 시약은 산화되고 청색화합물이 형성된다.

  

(5) 양성균 및 음성균

① 양성균 : Aeromonas, Neisseria, Pseudomonas(보통 양성), Alkaligenes, Branbamella, Morracxella 등

② 음성균 : 대부분 Gram양성균, Yersinia, Brucella neotomae, Acinetobacter, Enterobacteriaceae 등

4. 아미노산의 decarboxylase 검사

* lysine-ornithine-arginine and decarboxylase test *

(1) 실험 목적

알칼리성 하에서 아미노산 탈탄산효소(decarboxylase)에 의하여 amine을 형성하는 균의 효소능력을 시험하는 것이다. 즉, 세균이 특정 아미노산을 분해하는지를 알아봄으로써 세균을 분류할 수 있다.

 

(2) 실험 원리

특정의 아미노산을 분해하여 amine과 CO2를 만드는 세균이 있다. Dcarboxylase는 아미노산의 carboxyl portion과 반응하여 alkaline reacting amine을 만드는 substrate-specific enzyme이다.

a. specific amine products

lysine → cadaverine

ornithine → putrescine

arginine → citrulline

b. 기전

 

(3) 실험에 쓰이는 배지

보통 amino acid 중 lysine, ornithine, arginine을 각각 1 %가 되게끔 Moller decarboxylase 기초배지에 첨가 후 멸균하여 사용한다. 배지 pH는 6.0이고 지시약으로 bromo cresol purple과 cresol red가 포함되어 alkali성에서는 자색(violet), 산성 하에서는 황색(yellow)으로 된다.

 

(4) 실험 방법

배지에 균 접종 시에는 amino acid가 포함되지 않는 대조군과, lysine, ornithine, arginine 배지에 접종하고 대조군을 포함해서 2～3 ㎖의 멸균된 액체 paraffin이나 mineral oil 등을 중첩한다.

 

(5) 결과 판정

모든 amino acid는 동일한 색 반응을 나타낸다.

- 양성: 혼탁한 자색(turbid purple); 맑은 자색 → 황색 → 혼탁한 자색

- 음성: 황색(포도당만 분해된 것); 맑은 자색→황색

 

(6) 양성균 및 음성균

① Lysine

- 양성균: Edwardsiella, Salmonella, Arizona 등

- 음성균: Shigella, Citrobacter 등

 

② Ornithine

- 양성균: Enterobacter, Salmonella(보통 양성) 등

- 음성균: Klebsiella, Citrobacter freundii 등

 

③ Arginine

- 양성균: Enterobacter cloacae, Enterococcal, Streptococcus spp. 등

- 음성균: Enterobacter spp.(보통 음성), Streptococcus avium, Streptococcus equinus, Streptococcus bovis 등

 

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 2부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 3부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 4부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]생화학적 검사를 통한 Staphylococcus spp.의 분리동정 5부