[혈액학개론]초생체 염색

실험 이론 및 원리

1. 서론

적혈구는 조혈동안 세포분열이 끝나고 세포질 성숙이 거의 완성된 정염석 적아구는 핵을 잃게 된다. 일반적으로 크기가 큰 어린 적혈구안에는 변동이 많은 양의 RNA를 함유하는 microsome이 남아 있게 되어 혈색소 합성도 느린 속도로 계속되게 된다. 적혈구가 Brilliant cresyl blue와 RNA 복합침전물을 가지고 있는 것을 망상적혈구 혹은 그물적혈구라고 한다. 즉, 초생체 염색을 하였을때 망상과립상 구조가 발견되는 적혈구로 핵이 없는 적혈구 가운데에서 가장 어리다. 전자현미경에서 이 그물구조는 RNA이며 그물적혈구의 증가와 감소는 적혈구의 생산능력, 즉 조혈기능의 지표로 활용하고 있다.

 

2. 염색 원리

혈액을 호염기성 색소액과 섞어 두면 적혈구 내에 남아있던 RNA는 호염기성 색소와 친화력이 있어 호염기성 색소에 염색된다. 이와 같이 혈구고정없이 혈액을 그대로 염색하는 방법을 일반적으로 초생체 염색이라고 한다. 다시말하면, 생체에서 채취하여 살아있는 상태의 세포를 염색하는 방법. 예를 들면 뉴트랄레드와 야누스그린을 엷게 도포한 깔유리에 극히 소량의 혈액을 봉입하면 혈구세포의 초생체 염색을 할 수 있다. 미토콘드리아도 야누스그린으로 염색된다. 이에 대해 생체염색에서는 생체에 색소액을 주입하여 관찰하거나 고정하여 절편으로 하여 검경하는 고정염색법도 있다.

 

3. 검사 원리

망상 적혈구는 미성숙한 무핵의 적혈구로서 세포내에 헤모글로빈 합성에 필요한 리보좀과 미토콘드리아를 가지고 있다. 혈액을 new methylene blue와 같은 초생체 염색시약으로 염색을 하면 망상 적혈구내 잔여의 호염기성 RNA가 망상물(reticulum)이나 과립으로 응집하여 진한 청색의 봉입체를 형성하므로 이를 현미경으로 관찰하거나 기기로 측정한다.

 

4. 검사 방법

검체는 EDTA 전혈이며, 검사시약은 New methylene blue solution이다.

methylene blue(1.0g), potassium oxalate (3.2g), 증류수 (200㎖)을 혼합한 후 여과하고, 실온보관한다.

1) 모세관튜브에 methylene blue 용액 ⅓, 전혈 ⅓ 을 넣고 잘 혼합한 다음 실온에 15분간 방치

2) 15분 후 잘 혼합한 뒤 도말표본을 만들어 건조시킨후 염색정도를 확인한다.

3) 저배율에서 이상적 구역을 찾고 고배율에서 적혈구가 100∼200개 정도 있는 부위를 찾는다.

4) 적혈구 1000개를 세는 동안 나타난 망상적혈구 수를 세어 %로 계산한다.

 

5. 검사 결과에 영향을 미칠 수 있는 사항

1) 전혈과 염색액의 혼합비율은 꼭 1:1이 아니라도 좋다. 심한 빈혈이라면 염색액을 적게, 혈색소 치가 높다면 염색액을 많게하여 혼합한다.

예) 혈색소 5 g/dl 이하 → 전혈 : 염색액 = 6 : 4, 혈색소 15 g/dl 이상 → 전혈 : 염색액 = 4 : 6

 

2) 염색시간을 꼭 정확히 지키지 않아도 되나 10분 정도로 하는 것이 좋다.

 

3) 망상적혈구는 성숙된 적혈구보다 비중이 낮아서 혼합물 내에서 적혈구 층의 윗쪽에 위치하므로

도말을 만들기 전 전혈과 염색액을 잘 혼합하는 것이 중요하다.

 

4) 도말표본의 건조상태가 좋지않을 때에는 반짝거리는 적혈구와 망상적혈구를 혼동할 우려가 있다.

 

5) 혈당치가 높거나, heparin을 사용하였을 때는 염색이 흐리다.

 

6) 오차허용 범위 : 정상 범위에서 ±25%, 5% 망상적혈구 수에서 ±10%

 

7) 검체 부적합성 판정기준은 실온에는 6시간, 냉장에는 24시간 이상 방치된 검체 및 미세한 응고

 

6. 검사 결과

적혈구(total RBC count) 당 망상적혈구의 백분률(%)로 표시되는데 참고치는 성인 남자일 경우 0.5∼1.5%, 성인 여자는 0.5∼2.5%이다. 신생아는 2.0∼6.0%으로 높지만, 1～2주가 지나면 성인 수준으로 내려온다

 

 

실험 기구 및 시약

1. 시험 재료

EDTA tube에 담긴 혈액, 초생체 염색:New methtlene Blue

실험 방법

1. 측정 방법

1) 혈액을 작은 시험관에 적당량을 넣은후 시약을 동량으로 잘 혼합한다.

 

2) 약 5분정도 방치후 다시 섞은 후 Slide에 한 방울 떨어 뜨린후 스미어 한다.

 

3) 아이디어존에서 400에서 상을찾아 오일을 떨어트린후 1000배에서 검경한다.

 

4) 한 시야의 개수를 파악하여 1000개의 수를 맞춰 망상 적혈구를 센다.

망상적 혈구 수 = 망상적 혈구/1000개의 적혈구 수(적혈구 수+망상적 혈구 수)×100

(정상범위) 성인:0.1～1.5%

 

주의 사항

1. 초생체 염색으로 그물적혈구와 구별하기 어려운 것들은 하인츠 소체나 파펜하이머 바디 HbH의 침전물이 있다.

2. 퇴색하기 쉽기 때문에 2일 이내에 검색해야 한다.

3. 김자나 라이트염색시 영구표본이 되지만 색소침착으로 혼동이 되는 경우가 있어 주의해야 한다.

토의 사항

1. 임상적 의의

그물적혈구 수의 증감은 적혈구 생산능력을 잘 반영하는 골수에서 적혈구 항진, 감소는 저하를 의미한다. 그러나 골수내 적혈구의 절대수가 감소하고 있는 경우에는 그물 적혈구 수도 감소한다.

거의 용혈빈혈,영양소 결핍에 따른 빈혈환자에게 그 영양소 투입시 5~10일째에 일과성 으로 현저한 증가가 일어난다. 이것을 그물 적혈구 분리라고한다.	재생불량빈혈,악성빈혈,AL
증가하는 질환	감소하는 질환

 

2. 실험 고찰

임상적의의를 보며 각 증가하는질환과 감소하는 질환을 볼 수 있고 주의점을 토대로 감별시 혼동하면 안된다. 밑에 있는 표를 참고하여 주의하여아하고 망상 적혈구는 성숙된 적혈구보다 비중이 낮아서 혼합물 내에서 적혈구위에 가라앉기 때문에 도말을 만들기전 전혈과 염색액을 잘 혼합하는 것은 매우 중요하다.또한 도말표본의 건조상태가 좋지 않을 때 반짝거리는 적혈구는 망상적혈구와 혼동할 우려가 있으니 주의해야 한다.

종 류	성 분	감 별 점
망상체	Ribosomal RNA	초생체 염색에서 망상 또는 푸른색 과립
Pappernheimer 소체	철 함유물	서너개의 작은 푸른색 과립이 적혈구 가장자리 근처에 뭉쳐 있음. 철염색으로도 감별함.
Heinz 소체	변성된 Hb	Pappnheimer 소체보다 크고 불규칙한 형태를 보이며 주로 적혈구 가장 바깥쪽 가장자리에 붙어 있으며 푸른색으로 염색됨
Howell-Jolly 소체	DNA	Pappnheimer 소체보다 크고 경계가 분명하며 적혈구 중심근처에서 주로 관찰되고 푸른색으로 염색됨. DNA염색법인 Feulgen 염색 또는 Romanowsky 염색으로도 감별함
HbH 함유물	변성된 HbH	짧은 염색시간으로는 관찰되지 않으며 여러개의 구형의 과립이 골프공 형태로 보임