[식품미생물학실험]면전 만들기(Cotton plugging)

실험 목적

1. 기초적 실험도구 면전 만들기의 숙달 및 이해

대표적인 기체 제균 방법인 면전을 제작해봄으로써 미생물 실험에 필수적이고 기본적인 입구 봉쇄 방법을 배우는 것을 목적으로 한다. 면전은 미생물, 먼지 등 입자가 큰 물질은 통과하지 못하게 하고 공기는 자유로이 통과시킬 수 있으므로 편성 혐기성균을 제외한 일반 미생물 배양에 적합하다. 

먼저, 손바닥 크기의 탈지하지 않은 솜 위에 처음보다 약간 작은 솜을 쌓고, 사각모퉁이를 조금씩 잘라 중앙에 옮겨 심을 만든 다음 엄지손가락으로 중앙을 눌러 단단히 한 뒤, 한 손의 검지와 엄지를 모아 면전의 뚜껑을 둥글고 단단하게 만든다. 나머지 한 손으로 시험관에 솜을 적당한 비율과 모양으로 넣어주면 cotton plugging이 완료된다.

실험 이론 및 원리

1. 면전

각종 시험관이나 flask에 배지를 넣고 배양할 때에는 배양용 마개인 면전을 하여야한다. 면전이란 미생물의 성장에 필요한 공기는 통과시키고 실험 미생물을 오염시키는 공중의 미생물과 먼지 등은 통과시키지 않는 마개이다. 재료는 탈지하지 않은 목화 솜이다. 여기에 사용하는 솜은 섬유가 길고 탄력성이 강한 것이 좋다. 면전의 장점은 다른 플라스틱이나 고무 마개보다 저렴하고, 공기의 출입이 가능하여 미생물 배양에 더 적합하다는 것이다.

면전의 단점은 만들기가 쉽지 않다는 것이다. 면전의 머리 부분을 단단하게 만들어 시험관에 돌리면서 꽂아 넣어야하고, 꼬리부분이 너무 길지 않고 끝은 둥글게 만들어 시험관 안의 배지가 면전에 닿지 않게 하여야한다. 또한 꼬리부분은 머리길이보다 약 2배정도가 되어야 잘 만들어진 면전이라 할 수 있다. 이런 면전을 만드는 방법과 조건이 까다롭다는 것이 단점이라 할 수 있다.

 

2. 탈지되지 않은 솜을 사용하는 이유

면전의 재료는 탈지하지 않은 목화 솜을 이용하는데 탈지한 약솜을 사용하지 않는 이유는 탈지한 약솜은 흡습성이 높아 외부로부터 쉽게 오염될 수 있고, 배지가 자칫 닿을 경우 제대로된 실험이 이뤄지지 않는다.

 

3. Screw cap, rubber, 면전의 차이점

최근에는 면전대신 제품화된 screw cap, rubber의 사용이 증가하고 있다. screw cap은 나사가 달려있어 돌려서 용기를 닫을 수 있는 구조로 되어있고, rubber는 고무마개로써 혐기성 미생물을 배양할 때 쓸 수 있다. 면전은 이들과 달리 공기의 출입이 가능하여 호기성 미생물을 배양할 때 쓸 수 있다.

 

4. 건열/습열 멸균법

1) 건열 멸균법

건열을 이용한 멸균의 원리는 열에 의한 미생물 효소의 변성, 미생물의 탈수 및 산화 효과에 의한 사멸이다. 건열에 의한 뜨거운 공기는 미생물과 같은 차가운 본체를 쉽게 이동하지 못한다. 습열에 의한 에너지가 좀 더 쉽게 미생물의 본체를 효과적으로 이동할 수 있다.

① 건열멸균기(dry oven)에 의한 멸균

건열을 이용한 건열멸균기의 표준 적용은 170℃ 온도에서 2시간 작용시키는 방법이다. 이 방법은 초자기구나 유리 피펫과 같이 열에 저항할 수 있는 고체 물질의 멸균에 자주 이용될 수 있지만 열에 의해 물리적 성질이 변하는 폴리에틸렌이나 플라스틱 용기 멸균에는 사용할 수 없다.

② 소각(incineration)

직접 화염을 이용하는 방법으로 백금이를 알코올램프에 멸균하는 방법이 대표적이다. 이 방법은 손쉬운 방법이기는 하지만 백금이에 묻어 있는 세균 등이 열에 의해 튀어나가 주위를 오염시킬 우려가 있다.

2) 습열 멸균법

습열을 이용한 살균의 원리는 열에 의한 미생물 효소의 변성이다. 이러한 습열을 이용한 미생물 성장 조절방법에는 대표적으로 저온살균법(pasteurization), 자비(boiling), 및 가압멸균(autoclave)이 있다.

① 저온살균법(pasteurization)

저온살균법은 Pasteur가 포도주의 산패를 방지하기 위해 고안한 방법이라고 해서 붙여진 이름이다. 이 방법은 병원균으로 지정된 미생물의 사멸을 위하여 온도를 63℃로 유지하여 30분 혹은 72℃로 15초 처리하는 방법이다. 현대에 와서는 우유를 살균하는 방법으로 이용되고 있으며 이 방법을 변형한 초순간고온살균법(121℃～125℃, 1～2초)이 우유 살균법으로 이용되고 있다.

② 자비법(boiling)

이 방법은 100℃에서 10분간 작용시키는 방법으로 세균의 영양형은 사멸시킬 수 있지만 내생포자를 갖고 있는 세균을 사멸시키지는 못한다. 이 방법을 응용하여 간헐적으로 가열을 반복하고 열에 저항성인 내생포자 형태의 세균을 사멸하는 방법을 간헐 멸균(fractional sterilization) 혹은 저온 간헐멸균법(tyndallization)이라고 한다.

③ 가압 증기 멸균

습열멸균의 가장 효과적인 방법은 일정한 압력 하에서 증기를 이용하는 가압멸균법이다. 압력이 증가하면 물의 끓는점이 높아지고 고온과 함께 증기가 생산된다. 가압멸균의 표준조건은 15psi 121℃에서 15분 처리하는 방법이다. 이 방법으로 내생포자를 포함한 모든 미생물을 사멸시킬 수 있다. 가압멸균은 열과 압력에 물리 화학적 구조가 변하는 플라스틱 기구 등의 멸균에 사용할 수 없으며 이당류 이사으이 당을 가압멸균하면 화학구조가 단절되기 때문에 이당류 이상의 당이 포함된 배지를 멸균할 때는 115℃～118℃에서 10분 정도 멸균한다. 또는 기본 배지만 가압멸균하고 이당류 이상의 당은 여과멸균하여 혼합하는 방법을 이용한다.

 

5. Autoclave

Autoclave란 습열 멸균의 하나의 방법인 고압증기멸균을 하는 기계이다. 고압증기멸균은 autoclave를 사용하여, 100℃이상의 고압증기로 멸균하는데 보통 한 번의 멸균으로써 충분하다. 1.1㎏/㎠(15lb/inch2) 121℃에서 15～20분간 처리함으로써 멸균할 수 있다. 121℃ 상태에서 멸균을 시작하기 전에 멸균통에 있는 공기를 제거하는 것이 중요하다. 또한 멸균의 효과를 높이기 위해 멸균통에 충분한 통기 공간이 있도록 멸균 재료를 알맞게 넣는 것이 좋다. 최신용 autoclave는 공기를 자동 제거하는 장치가 되어 있으며, 멸균 조작자체도 자동화되어 있다. 열에 안정한 배지 등의 멸균에 많이 쓰인다.

Autoclave의 구조

물을 아랫부분에 넣고 배기밸브를 잠근다. 그리고 배지를 담은 용기는 황산지나 알루미늄박 등으로 덮어 씌우고 금속망에 넣어서 멸균기 안에 넣는다. 이를 씌우는 이유는 고압으로 인해 면전이나, 마개사이로 외부 물질이 들어갈 수 있기 때문이다. 다음 뚜껑을 잠그고 스위치를 넣는다. 압력조절밸브는 사용하고자 하는 위치에 맞추어 놓으면 그 후로는 자동적으로 끓고 탈기되며 소정의 압력에 달하면 타임스위치가 자동으로 작동된다. 시간이 되어 열원이 끊어지면 압력계가 0을 나타낼 때까지 기다린다. 이때 압력이 내려갈 때까지는 절대로 뚜껑을 열지 않는다. 수증기가 분출할 위험이 있기 때문이다.

 

6. Agar와 broth의 차이

broth는 액체배지에 쓰이는 약간 끈적이는 배양액이고, Agar는 액체배지에 첨가하면 고체나 반고체배지가 되는 고체, 반고체배지의 주재료이다. 또한 Agar는 복합 탄수화물 류인 다당류이다.

 

7. 사면배지, 고층배지

사면배지란 시험관에 배지가 사면이 되도록 굳힌 것이다. 세균의 증식, 보존 등에 쓰인다. 사면배지를 만들 때 주의 할 점은 배지가 너무 경사지거나 배지 양이 많아서 시험관의 입구 가까이 도달하지 않도록 주의한다. 대개 시험관의 1/2 정도가 적당하다. 준비된 배지는 4℃에 보관한다.

고체배지의 형태

고층배지란 시험관에 배지를 1/3 높이로 분주, 멸균한 것을 바로 세운 그대로 응고시킨 것이다. 고층배지는 세균의 성상 검사, 균주의 보존 등에 쓰인다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

목화솜(탈지 하지 않은 것), 시험관

실험 방법

1. 실험 과정

1) 먼저 목화솜을 손바닥 크기 정도로 적당한 크기로 자른다.

2) 솜 위에 조금 적고 얇은 솜을 포개어 얹고, 목화솜의 모퉁이를 조금씩 잘라 중앙에 옮겨 심을 만든다.

3) 다음 엄지손가락으로 중앙을 눌러 단단히 만든다.

4) 다음 왼손 검지와 엄지로 구멍을 만들고 그 안으로 솜의 중앙을 오른손 엄지손가락으로 넣어서 면전의 머리 부분을 단단히 만든다.

5) 단단해진 머리 부분을 지탱하는 구멍을 만든 검지와 엄지가 절대 풀리지 않도록 꼭 쥐고 있는 것이 중요하다.

6) 단단한 머리부분을 유지한 채 꼬리부분을 시험관 안에 집어 넣는데 이때 면전을 오른쪽으로 돌려 넣으며, 시험관을 회전하면서 천천히 밀어 넣는다.

7) 너무 무리하면 시험관 주둥이가 파손될 염려가 있으니 주의 해야 한다.

8) 꼬리의 끝 부분은 둥근 모양을 유지해야하고, 꼬리 부분의 길이는 약 2cm 정도로 머리 부분의 길이의 약 2배정도면 적당하다.

 

실험 결과

1. 결과 사진

꼬리부분을 보면 대부분 모두 둥글게 되어 있고, 머리부분과 꼬리부분의 비율도 1:2정도로 대체적으로 잘 만들어진 면전인 것 같다. 하지만 머리부분의 조금 나와 있는 솜털들만 정리해주면 좋을 것 같다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험은 시험관에 배지를 만들 때 이물질이 들어가지 않도록 마개 역할을 하는 면전을 만드는 실험을 하였다. 최근에는 screw cap이나 rubber 와 같은 플라스틱과 고무마개로 많이 사용하여서 면전을 접해 보지 않았다. 면전의 역할은 미생물을 배양하는데 필요한 공기는 통과시킬 수 있고 다른 이물질들은 통과를 못하게 하는 것이 역할이다. 면전의 역할이 미생물 배양에 매우 중요하기 때문에 면전을 잘 만드는 것이 중요하다.

처음에는 면전을 만드는 것이 쉽게만 느껴지고 일찍 끝날 것 같았는데 이 면전의 심 부분 즉 머리 부분을 단단하게 만드는 과정이 생각 보다 어려웠다. 단단하게 만들었다 하여도 시험관에 끼워 넣을 때 머리를 쥐고 있는 엄지와 검지가 풀리게 되었다. 이 부분에서 수많은 실패가 있었다. 목화솜의 양의 한계로 인해 실패한 솜을 재사용 하여 면전을 만들었는데 방법은 면전을 고르게 다시 편 다음 손바닥으로 몇 번 두드리면 다시 평편하게 솜이 배열이 되어 사용할 수 있다. 하지만 재사용하는 솜으로 만들 때에는 머리 부분을 만들 때 구멍이 생기는 현상이 발생하였다. 

따라서 중앙에 솜을 보다 더 포개어 만들었더니 솜이 찢어지는 것을 해결할 수 있었다. 머리 부분 뿐 아니라 꼬리부분을 시험관에 끼워 넣을 때에도 처음에는 너무 꼬리부분 솜을 많이 하여 잘 안들어 갔었는데 몇 번의 실패 끝에 적당한 양의 솜으로 넣는 것에는 성공하였다. 하지만 꼬리부분이 너무 길어서도 안 되고 둥글게 말아져야 좋은 면전이 된다. 이는 시험관 안의 배지가 솜에 사면배지 일 때 면전에 오염되지 않게 하기 위해서이다. 

그래서 솜을 시험관 입구에 걸쳐서 둥글게 말려지게 돌려 넣으면 된다. 하지만 꼬리부분을 돌려 넣다가 머리 부분이 풀려 단단하게 만들어지지 않는 경우가 다반사였다. 이러면 시험관 안으로 이물질이 들어갈 수가 있어 쓸 수 없는 면전이 되기 때문에 다시 만들어야 했다. 하지만 면전을 만들 때 손으로 솜을 만지기 때문에 특히나 꼬리부분을 손으로 만질 경우 오염이 될 수 있으니 주의를 하고 꼭 면전 만들기를 하기 전에 손을 청결히 해야 할 것 같다.

대체적으로 실험의 면전은 위의 사진과 같이 머리 부분이 많이 크지 않고 적당한 크기와 머리와 꼬리부분의 비율도 1:2정도로 알맞았다. 면전이 screw cap이나 rubber랑은 달리 공기의 출입이 가능하여 미생물 배양에 좋으나 만들기가 어려운 단점이 있으나 면전 만들기에 능숙해지면 면전이 다른 마개보다 더 유용할 것 같다.

참고 문헌

1. 최신실험미생물학. 미생물 및 면역학 분과회. 2011. 신일북스, p.6,51～53.

2. 임상미생물학 기본실습. 김충환 외. 2013. 청구문화사, p.28～30.

3. 식품미생물학 및 실험. 허윤행 외5명. 2014. 지구문화사, p.370～371.

4. 미생물학 길라잡이. 현형환 외5명.2010. 라이프사이언스, p.64～68.