[분석화학실험]UV-Vis spectrophotometer를 이용한 정량분석

실험 목적

UV-Vis spectrophotometer를 이용해서 미지시료에 있는 구리이온의 양을 측정하기 위한 정량분석법을 배운다.

실험 이론 및 원리

1. UV-Vis Spectrophotometer (자외선-가시선 분광광도계)

어떤 시료 분자가 어느 파장의 빛을 흡수하며, 그 흡광도는 얼마나 되는지 측정하는 기기 장치

UV 분광기는 자외선을 사용하며, 이 영역의 빛을 사용하면 분자의 결합전자가 들뜨게 되면서 빛의 흡수가 일어나고 이것을 측정한다. 분자의 구조를 밝히는 데에는 결정적이지 못하며, 주로 파이전자계를 확인하는데 사용된다. 단일결합의 경우 결합전자가 들뜨는 데 필요한 에너지가 매우 크므로 (즉 파장은 짧 아지므로 UV를 넘어감) 이 영역에서는 사용할 수 없다. 또한 UV는 가시광선 영역과 같이 분석물의 농도 측정에도 유용하게 쓰인다. Beer의 법 칙에 따라 흡광도는 물질의 농도에 비례하므로 빛을 얼마나 흡수했느냐에 따라 그 물질 의 농도를 계산 할 수 있게 된다.

UV/VIS 분광광도계는 많은 유/무기 화합물의 정량, 임상실험 등에 널리 쓰이는 분석기 기이며, 화합물의 구조를 밝히는데도 어느 정도의 정보를 제공 하지만, 구조의 파악보다 는 정량분석에 더 중점을 두어 사용되고 있다.

UV/VIS는 AAS 같은 기기와는 달리 원자에 대한 측정이 아닌“분자”에 대한 측정이 가 능하다. 분자내의 파이결합이나 n 정자가 있는 경우 UV/VIS 영역의 빛을 흡수하여 최외 각 전자의 들뜸 현상이 일어나기 때문이다.

 

2. UV-Vis spectrometer 구성

UV/Vis spectroscope의 실제 형태는 매우 다양하지만 기본적인 구성요소는 비슷하다. Single-Beam UV-Vis Spectrophotometer에서 각각의 파장에서 시료와 용매의 흡광도 는 수동으로 측정해야 한다.

1) 광원(Light source)

광원이란, 빛을 생성하여 흡광도를 측정하는 전 파장영역에 일정한 세기를 유지, 충 분한 복사선 에너지를 공급. UV-Vis 영역을 측정하는 데 사용되는 대부분의 분광광도계에는 텅스텐과 중수소램 프가 모두 사용. 이런 기기에서는 램프를 바꾸기 위해 광원 선택기를 사용, 하나의 넓은 범위의 광원의 되도록 두 광원의 빛을 동시에 사용.

2) 단색화 장치 (Monochoromator)

회절격자 및 입사슬릿, 방출슬릿으로 구성되며, 회절격자를 회전시킴으로써 임의의 단 색광을 입사슬릿으로부터 나오게 하며, 이 빛은 다시 회절격자를 총해 분산되어 방출슬 릿으로 전달된다. 다시 말해, 광원으로부터 들어온 연속파장의 자외선 및 가시선을 각 파장별로 분산시켜 단색파장으로 만드는 장치이다. 슬릿의 폭이 좁을수록 파장의 범위 가 좁은 광이 얻어지므로 해상능력은 좋아지나 광원의 에너지 값이 감소하여 검출능이 낮아 질 수 있다.

3) 시료장착부

시료장착부(sample compartment)는 시료를 빛의 통로에 올려놓는 부위로서 시료가 특 성에 따라 적절한 시료 용기 또는 악세사리가 사용된다. 이 때 시료 용액을 담는 용기 는 측정하고자 하는 파장의 빛을 흡수하지 않아야 한다. 자외선-가시광에 대하여 투명 한 석영으로 만든 관이 가장 널리 사용되는데 ,빛의 통과거리가 0.1㎝, 0.5㎝, 1.0㎝ 등이 되도록 제작되어 있다. 경우에 따라 온도 조절기나 자동 시료 교환 장치 등을 시 료장착부에 설치하기도 한다.

4) 검출기

빛이 시료를 통과하기 전과 후의 빛의 강도를 측정 함으로써 시료가 흡수한 빛의 양을 측정하는 부위가 검출기이다. 자외선/가시광선 범위의 빛을 검출하는 검출기에는 보통 3가지 종류가 있으며 이들은 각각 감도, 응답시간, 사용되는 파장범위 및 출력의 형태 등에 따라 차이점을 갖고 있다. 대부분의 기기에서는 광전증배관 또는 광전관이 사용되 고 있으며, 광전자발생 간 및 Pbs cell과 같은 광전장치, 자외선/가시부 전체 스펙트럼 영역을 매우 짧은 시간에 얻을 수 있는 광다이오드 어레이나 CCD등도 개발되어 사용 되고 있다.

5) 전자, 전기 및 기계 장치

분광광도계에는 광원, 검출기 및 분광광도계 여러 부위에서 필요한 안정된 전원을 공급 하는 장치, 단생광기 구동 장치, 슬릿의 폭 조절 장치, 시료부 제어장치 등 여러 전기적 기계적 장치가 필요하다.

6) 결과 표시부

얻어진 결과를 적절한 형태로 표시할 수 있는 장치 및 부가적인 연산을 위한 컴퓨터 자 료 처리 시스템, 프린터도 분광광도계의 중요한 구성 요소가 된다.

UV와 Visible, 즉 자외선과 가시광선 영역에 해당하는 파장을 가지는 빛은 분자가 가 진 전자에 에너지를 주어 더 높은 에너지 준위를 가질 수 있도록 할 수 있는 정도의 에너지를 가진다. 원자/분자의 전자의 에너지가 양자화 되어있다는 것을 알고 계시면 쉽게 이해 할 수 있다. 이 에너지는 분자마다 다르며 고유하다. 즉, 쉽게 얘기하면 분자마다 잘 흡수하는 파장 의 빛이 다르다는 거다. UV-Vis는 이 점을 활용하여 이번실험에 응하게 된다.

① 넓은 범위의 파장의 빛을 투과시키면서 흡광도를 측정하여 흡광도가 특히 높은 파장 을 찾아 물질의 정성적인 분석, 즉 이 용액에는 어떤 물질이, 혹은 몇 가지의 물질 이 들어있다는 식의 분석을 하거나,

② 어떤 분자가 잘 흡수하는 특정한 파장의 빛을 투과시켜 흡광도를 측정함으로서 그 분자의 정량적인 분석, 즉 이 용액에는 이 물질이 얼마나 들어있다는 식의 분석을 하게 된다고 한다.

 

3. 분석순서

1) 일정한 농도간격으로 제조된 표준구리용액의 Absorbance를 측정하여 Standard curve를 작성한다.

2) 미지시료의 Absorbance를 똑같은 파장에서 측정한다. 이때 측정된 Absorbance값 이 1.0보다 클 경우 증류수로 정확하게 일정한 비율로 희석하여 1.0보다 작은 Absorbance가 얻어지도록 해서 측정한다.

3) 측정한 Absorbance data를 excel 등을 이용하여 Standard curve작성하고 주세선 을 표현하는 식을 최소자승법으로 구한다.

4) 미지시료에서 구한 Abs를 3)번에서 구한 식에 대입하여 미지시료의 구리농도를 정 확하게 계산한다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

1) tube 14개, tube stand, 5㎖, 10㎖ 피펫 각각 2개씩

2. 실험 시약

1) CuSO4 0.5M 500㎖ 용액

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 아래 표에 지시된 비율로 CuSO4 0.5M용액을 희석한다.

	0	50	100	150	200	250	300	350	400	450	500
증류수,㎖	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1	0
CuSO₄0.5M, ㎖	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

이때, 6~10㎖은 10㎖피펫을 1~5㎖은 5㎖ 피펫을 각각 사용한다.

2) 각 test tube의 입구를 parafilm으로 밀봉한 후 다음 6~7회 뒤집으면서 잘섞어준다.

3) 스포이드를 사용하여 10㎜ pathlength cuvette로 옮긴다. cuvette 부피의 2/3정도 채워준다.

4) 미지시료도 같은 식으로 cuvette로 옮긴 후 Absorbance를 측정할 준비를 한다.

5) UV-Vis spectrophometer를 사용하여 620㎚에서의 흡광도를 측정한다.

이때, 빛이 지나가는 선상에 아무 것도 넣지 않은 상태에서 Absorbance=0.00이 되 도록 조정한 후 실험을 시작한다. 미지시료의 Abs가 1.0보다 클 경우, 증류수로 희 석하여 Absorbance가 1.0보다 작은 값이 되도록 한다. 사용된 희석률을 정확히 기 록 해둔다.

6) Abs 측정이 완료되었으면 실험대로 돌아와 사용했던 cuvette를 증류수로 깨끗이 rinsing한 후 기다리는 조에게 인계한다.

7) 얻어진 data를 Excel에서 분석하여 standard curve와 직선식을 구하고 이것을 이용 하여 미지시료의 농도를 계산하여 전체 과정과 계산과정 및 결과를 보고한다.

실험 결과

1. CuSO4 농도 계산

① CuSO4의 농도, ㎜

	CuSO4의 농도, ㎜
	0 blank	50	100	150	200	250	300	350	400	450	500
증류수, ㎖	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1	0
500㎜ CuSO₄,㎖	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
총 부피,㎖	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
Absorbance 측정값	0.0684	0.1658	0.2336	0.3143	0.3936	0.4792	0.5750	0.6699	0.7656	0.8661	0.9904
corrected Abs	0	0.0974	0.1652	0.2459	0.3252	0.4108	0.5066	0.6015	0.6972	0.7977	0.922

 

미지시료 1 : 0.3715 Abs - blank (증류수) = 0.3031 (Corrected Abs)

미지시료 2 : 0.2424 Abs - blank (증류수) = 0.174 (Corrected Abs)

미지시료 3 : 0.2012 Abs - blank (증류수) = 0.1328 (Corrected Abs)

 

② CuSO4의 Standard Curve

2. 미지시료의 농도 계산 

① 미지시료1의 Cu2+ 농도

미지시료 1 Corrected Abs : 0.3031

y = 0.0018x - 0.0241 식 값에 y에 미지시료1 값을 대입한다.

0.3031 = 0.0018x - 0.0241

0.0018x = 0.3031 +0.0241

0.0018x = 0.3272

x = 181.78㎚

∴ 따라서 미지시료 1의 농도 : 181.78 ㎚

 

② 미지시료1의 Cu2+ 농도

미지시료 2 Corrected Abs : 0.174

y = 0.0018x - 0.0241 식 값에 y에 미지시료2 값을 대입한다.

0.174 = 0.0018x - 0.0241

0.0018x = 0.174 +0.0241

0.0018x = 0.1981

x = 110.06㎚

∴ 따라서 미지시료 2의 농도 : 110.06 ㎚

 

③ 미지시료1의 Cu² 농도

미지시료 3 Corrected Abs : 0.1328

y = 0.0018x - 0.0241 식 값에 y에 미지시료3 값을 대입한다.

0.1328 = 0.0018x - 0.0241

0.0018x = 0.1328 +0.0241

0.0018x = 0.1569

x = 87.17

∴ 따라서 미지시료 3의 농도 : 87.17 ㎚

토의 사항

1. 실험 고찰

기기를 사용해서 여러 실험을 했다. 이번 실험은 미지시료에 있는 Cu2+ 농도의 양을 정 량하기위해서 UV-Vis spectrophometer를 사용하게 됐는데 cuvette를 처음 접해봤는 데 정확한 실험 결과 값을 얻기 위해서는 불투명한 부분을 잡으면서 실험을 해야 한다. 그리고 CuSO4를 희석할 때 정확한 양을 넣어야 좀 더 확실한 실험 결과 값을 구할 수가 있다. 그러므로 CuSO4의 희석할 때 정확한양을 넣도록 주의하며 실험해야했다. 우리 조는 희석하는 과정이 잘 이루어 지지 않았는지 R2값이 그렇게 높지 않게 나왔다.

 

2. 생각해 볼 문제

① Abs가 1.0보다 현저히 클 경우 적절히 희석하여 1.0보다 Abs가 작도록 만든 다음 측 정하는 이유는?

Abs가 1.0을 넘어가게 된다면 실험값의 정확도가 떨어지게 되므로 Abs 값이 1.0이 넘지 않도록 희석하여 실험을 해야 한다. 희석한 후 측정 하였다면 계산 값에 희석배 율만큼 곱한 결과를 최종 농도 값으로 결정한다.