[미생물학실험]세포의 관찰 3부

실험 이론 및 원리 - 3

12. 효모의 분류방법

효모의 분류에서 어느 한 가지 절대적인 기준은 존재하지 않으며, 형태, 생리, 분자생물학적인 특성을 종합하여 분류하는 다상적 분류방법을 따른다. 유성생식 과정이 밝혀져 있으며, heterothallic reproduction을 하는 경우 교배여부가 종을 구분하는 중요한 기준이 될 수 있지만, 유성생식 생활사가 밝혀져 있지 않거나 homothallic인 경우 교배에 의해서 종을 구분하는 것은 불가능하다.

 

교배외에 세포 및 자실체의 형태, 다양한 탄소원과 질소원의 이용여부, 성장 온도 등의 생리적 특성, ubiquinone의 종류, fatty acid profile, 세포벽 구성성분, G+C content 등의 생화학적인 자료, DNA 염기서열의 계통학적인 분석, DNA-DNA reassociation, PFGE를 이용한 핵형분석 등이 분류학적으로 이용되어 왔다.

 

형태, 생리, 생화학적인 특징들의 경우 homoplasy가 심한 경우가 많아서 종과 종간의 관계를 규명하는 데는 많은 어려움을 주어왔다. 이러한 사실은 최근의 분자계통학의 결과에서 밝혀지고 있다.

 

13. 효모의 동정방법

1) 형태적 특성에 의한 동정

목이버섯과 같이 복잡한 모양의 자실체를 형성하는 경우 자실체 및 미세구조의 형태적 특성이 동정의 좋은 key가 될 수 있지만 대부분의 경우 매우 단순한 형태의 세포모양을 가지고 있기 때문에 형태적 특징만으로 효모를 동정하는 것은 불가능하다.

 

2) 생리적 특징에 의한 동정

분자생물학적인 방법이 발전하기 전까지 주로 사용되어온 동정 방법이다. 다양한 생리적 특징은 종과 종간의 구분을 가능하게 한다. 그러나 효모의 종수에 비해서 구분에 사용되는 특징의 수가 너무 적기 때문에 각 특징은 homoplasy가 매우 심하고, 같은 종의 경우에도 서로 다른 균주간에 변이가 심한 특성을 보이기 때문에 때로는 동정을 힘들게 하는 경우가 있다. 생리적인 특징을 데이터베이스화하고 kit화해서 동정할 수 있는 방법으로 Biolog kit와 API kit가 있다.

 

3) DNA 염기서열 분석

현재 가장 광범위하게 자료가 축적된 DNA는 26S rDNA의 D1/D2 domain이다. 대부분의 type strain에 대한 자료가 축적되어 있어서 동정에 있어서 가장 우선적으로 시행할 수 있는 방법이다. 이 부분의 염기서열이 1% 이상의 차이를 보이면 다른 종이라고 인정되고 있다. 그러나 99% 이상의 similarity를 가진다고 해도 반드시 같은 종이라고 할 수는 없다. 그러나 일반적으로 반대되는 증거가 수집되지 않는 한 99% 이상의 유사도를 보이면 같은 종으로 인정되고 있다.

 

4) DNA-DNA reassociation

이 방법은 동정하고자 하는 균주의 분류학적인 위치가 거의 결정되고 난 후 실행할 수 있는 동정법으로서 핵 DNA간의 상보성을 조사하는 방법이다. Heterothallic yeast의 교배와 reassociation 정도를 비교한 결과 DNA-DNA reassociation 정도가 70% 이상인 경우 같은 종이라고 인정되고 있다. 이 방법은 DNA 염기서열에서 종을 결정 짓지 못한 경우 최정적으로 사용할 수 있는 방법이다.

 

5) 교배에 의한 동정

생물학적인 종개념하에서 가장 명확한 종 동정 방법이다. 그러나 이 방법은 여러가지 조건이 갖추어졌을 때에 한해서 시행할 수 있는 방법이다. 첫째, 동정하고자 하는 균주가 heterothallic한 종이어야 한다. 둘째, mating type이 다른 균주를 확보하고 있어야 한다. 셋째, 유성생식을 유도할 수 있는 환경조건을 알고 있어야 한다. 따라서 이 방법은 매우 제한적인 경우에만 실행하며 일반적으로는 시행하지 않는 방법이다.

 

14. 세균의 도말표본 제작법

보통 세균의 표본은 슬라이드 글라스위에 바르므로 도말표본이라 한다. 슬라이드 글라스는 사용하기 전에 지방을 완전히 제거할 필요가 있다. 슬라이드 글라스에 물을 떨어뜨려 물이 전면으로 잘 퍼지면 지방이 제거된 것이고 물방울을 형성하면 아직도 지방이 남아 있는 것이다. 지방이 충분히 제거되지 않으면 세균이 슬라이드 글라스의 표면에 고정되지 않고 흘러가 버린다. 지방이 충분히 제거되지 않은 슬라이드 글라스는 불꽃 속을 몇 번 통과시켜 지방을 태워버림으로써 제거할 수 있다.

다음은 도말표본의 제작순서이다.

1) 도말

깨끗한 슬라이드 글라스를 코르넷 핀셋으로 고정하고, 피검재료가 액체인 경우에는 화염멸균한 백금이로 채취하여 유리면상에 둥글게 또 얇고 편평하게 편다. 또 피검재료가 집락과 같은 고체인 경우에는 미리 슬라이드 글라스에 멸균식염수 또는 증류수를 백금이로 한 방울 떨어뜨리고, 이 속에 미량의 피검재료를 백금이로 채취하여 얇게 바른다. 멸균백금이로 세균을 채취 할 때에는 백금이를 멸균하여 냉각한 후에 사용한다.

 

2) 건조

도말한 표본은 그대로 공기 중에 방치하여 자연 건조시킨다. 급할 때에는 도말면을 위로하여 밑에서 약한 불로 천천히 데우면서 움직여서 건조시킨다.

 

3) 고정

도말면을 위로 하여 버어너의 불꽃 속에서 서서히 몇 번 연속 통과시키면 균체는 그 원형질 성분이 고화되면서 유리면에 고정된다. 이 조작은 나중에 수세할 때에 균이 씻겨 내려가는 것을 방지하는 동시에 멸균 효과도 있다. 단순염색의 경우는 보통 화염 고정법을 쓰나 특별한 경우에는 메탄올, 에탄올, 포르말린, 오스뮴산 등으로 고정할 수가 있다.

 

4) 염색

염색법은 일반적으로 도말면이 전부 덮히도록 염색액을 충분히 떨어뜨려 보통 1~2분간 방치하고 여분의 염색액은 슬라이드 글라스를 기울여 버린다. 보통 단순염색에는 메틸렌블루 염색액과 푸크신 염색액을 사용한다.

 

5) 수세

약한 수돗물 또는 서서히 흐르는 물을 쓴다. 흐르는 물은 도말면의 뒷면에 댄다. 씻은 물이 무색으로 변할 때까지 천천히 씻는다.

 

6) 건조

표본을 여과지 사이에 끼고, 가볍게 눌러 수분을 흡수시키고, 공기 중에서 건조시킨다. 검경전에 표본위를 커버글라스로 덮는다.

 

7) 검경

먼저 저배율 렌즈를 써서 표본의 주요부분을 시야의 중앙에 둔다. 다음에 1000배 이상의 관찰이 필요한 세균 등은 유침해서 고배율로 본다.

 

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 광학현미경, Xylene, Immersion oil, 슬라이드글라스, 커버글라스

2) 실험배지, 백금선, 알코올램프, 성냥

3) 크리스털바이올렛 [crystal violet]

보라색의 색소 중에서 순수한 결정으로 최초로 얻어진 것이다. 다이메틸아닐린과 포스젠을 염화아연을 촉매로 하여 축합하여 얻는다. 견뢰한 염료는 아니지만 빛깔이 선명하고 값이 싸므로 명주·양모 등의 염색 외에 색연필·잉크 등의 착색에 사용된다. 또는 pH1.5 부근에서 산형(酸形)의 녹색으로부터 염기형의 푸른색으로 변하므로 산염기의 지시약으로 사용된다.

4) 배양기구

① 백금선 및 백금이

미생물의 이식 및 도말 등에 쓰인다. 선상의 백금선이 사용되나 보통은 염가의 니크롬선을 약 5㎝ 길이로 잘라 유리막대 또는 금속막대에 끼어 사용한다. 백금이는 니크롬선의 끝을 지름 약 2㎜로 감아 만든다. 백금선과 백금이는 사용전과 후에 반드시 알코올 램프나 버어너의 화염으로 멸균한다.

② 백금선 및 백금이의 멸균법

멸균하는 법은 먼저 백금선이나 니크롬선의 부분을 빨갛게 가열하고 다음에 자루의 금속부분의 반 가까이 까지 서서히 화염 속에 넣는다. 처음에 백금선을 환원불꽃(내염)에 넣고 다음에 서서히 산화불꽃(외염)에 넣는다. 왜냐하면, 갑자기 산화불꽃에 넣으면 균체가 불꽃으로부터 튀어 주위로 날아가 공기를 오염시킬 수 있기 때문이다.

실험 방법

1. 실험 과정

1) 박테리아와 효모가 들어있는 실험배지를 준비한다.

2) 실험 배지에 있는 집락을 백금선으로 채취하여 슬라이드글라스 위에 얇게 펴 바른다. 사용한 백금선은 알코올램프의 불을 이용하여 멸균한다.

3) 크리스탈 바이올렛 염색약을 한 두 방울 떨어뜨린 뒤 1~2분정도 염색이 되도록 기다린다.

4) 서서히 흐르는 물에 염색약을 씻는다.

5) 물기를 닦은 뒤에 기포가 생기지 않게 15˚의 각도로 커버글라스를 덮어준다.

6) 프레파라트를 광학현미경으로 관찰하는데 상이 흐릿하게 나올 경우 Immersion oil을 대물렌즈에 바른다. 그 뒤에 실험 끝난 후 Xylene으로 종이에 묻힌 뒤 대물렌즈를 닦아준다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

1번 효모는 작은 동그라미로 많이 퍼져있고

2번 효모는 상이 흐릿해서 보지 못했다.

3번 박테리아의 경우는 큰 동그라미 모양으로 보인다.

4번은 막대모양이 퍼져있는 것처럼 보인다.

 

토의 사항

1.  실험 고찰

효모가 박테리아보다 커서 x400배로 보기 때문에 쉽게 찾을 수 있었는데, 염색을 않고 물을 약간 묻혀 프레파라트로 만들어서 보니 눈에 띄는 것을 보지 못하고, 또 효모를 찾을 때 염색하지도 않았는데 광원을 강하게 하여 찾는데 어려움을 겪었다. 박테리아의 경우 효모보다 작아 x1000배로 관측해야 하기 때문에 그냥 찾기에도 힘이 든다. 

거기에 우리는 염색을 한 후 물로 염색약을 씻어 낼 때 박테리아 염색부위를 잘 씻지 못해서 광학현미경으로 관찰할 때 박테리아는 찾지 못하고 염색약만 보여 더욱 찾기 힘들었고, 그 프레파라트를 보기 위해서 시간을 너무 낭비해 나중에 다른 프레파라트를 만들어서 관측하기에 시간도 부족했다. 또 x1000배에선 현미경 상이 흐릿해지기 때문에 Immersion oil을 사용하여 상을 뚜렷하게 보이게 해야 했는데 실험시간동안 Immersion oil을 사용하지 않아 어려웠다. 또 박테리아를 백금선을 사용해서 실험배지 집락을 약간 취해서 슬라이드 글라스 위에 얇게 펴 바르는 과정을 하는데 너무 조금 취해 슬라이드 글라스 위에 펴 발라서 찾는데 오래 걸리기도 했다.

효모는 진핵미생물로서 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있는데, x400배로 관찰해서 그런지 세포 소기관은 커녕 효모 찾기도 힘들었다. 박테리아와 효모를 의 형태를 관찰 후 그 형태에 비슷한 박테리아와 효모를 찾으려 했으나 형태 맞추기도 실패했다. 그리고 박테리아의 경우 이번에도 늦게 찾아서 박테리아에서 수분이 빠져나가 제대로 된 모양의 박테리아를 관찰 할 수 없었다.

 

참고 문헌

1. 미생물학, 환경미생물학, 미생물의 생물학

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]세포의 관찰 1부

[Biology/미생물학] - [미생물학실험]세포의 관찰 2부