[일반생물학실험]단백질 정량 분석

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

본 실험은 여러 가지 단백질 정량 분석 방법 중에 Lowry법을 이용해서 농도를 알고 있는 단백질 시료들을 반응시킨 후에 Uv/Vis spectrophotometer를 이용해서 흡광도를 측정해 최적의 파장대에서 BSA Standard Curve를 작성하고, 미지 농도의 단백질 시료를 BSA Standard Curve를 이용해 농도를 알아보는 실험이었다. 

단백질 정량은 생화학, 생물학 분야에서 기초적인 과정이고, 이 분야에서는 중간에 실험에서 잘못이 있더라도 결과가 나올 때까지 알 수 없는 경우가 많아 기초 단계인 단백질 정량을 잘 아는 것은 매우 중요하기 때문에 본 실험을 배우고 진행하게 되었다.

실험 방법

1. 검량선 도출 및 최적 파장대 설정

1) BSA 원액 (2 ㎎/㎖)을 증류수로 희석하여 0, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 BSA 샘플을 제조한다.

Figure 1. BSA 샘플

 

2) 각 농도의 BSA 용액 200 ㎕ 에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1㎖씩 넣고, pipetting 해준다.

Figure 2. pipetting 해주는 모습

Figure 3. Lowry Reagent를 넣은 BSA 용액

 

3) 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100㎕씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.

Figure 4. Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent을 넣은 직후

 

4) 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.

Figure 5. Lowry 법의 색 변화(10분 후)

Figure 6. 반응이 완료된 시료(30분 후)

 

5) 최적의 파장대를 설정하기 위해 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 ㎚의 파장대에서 각 샘플의 흡광도를 측정한다.

Figure 7. 흡광도를 측정하는 모습

 

6) 최적의 파장대를 설정한 후, BSA standard curve를 도출한다.

 

2. 단백질 농도 측정

1) 미지 농도의 단백질 용액을 준비한다.

Figure 8. 미지 농도의 단백질 용액

2) 증류수를 이용하여(1 ㎖) 위 실험에서 설정된 파장대로 UV/Vis spectrophotometer의 Auto-zero를 설정한다.

 

3) 대조군 및 미지의 단백질 용액 200 ㎕ 에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1㎖씩 넣고, pipetting 해준다.

 

4) 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100㎕씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.

 

5) 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.

Figure 9. 반응이 끝난 미지 농도의 단백질 시료

6) 대조군 및 각 단백질 용액을 UV/Vis spectrophotometer를 통해 위에서 설정한 파장대에서 흡광도를 측정한다.

 

7) 주어진 BSA(Bovine Serum Albumine) Standard curve를 이용하여 각 단백질 용액의 농도를 구한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

처음에 200㎍/㎖ 농도의 BSA 용액을 받아, 1㎖를 피펫으로 빼내어 증류수로 희석해서 0, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도의 시료를 만들었다. 단백질 시료 200 ㎕ 에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1㎖씩 넣고 20분간 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100㎕씩 넣고 30분간 반응시키니 용액의 농도가 짙을수록, 진한 파란색을 띄었다. 반응이 끝난 각 용액을 큐벳에 담은 후, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 ㎚의 파장 대에서 각 샘플의 흡광도를 측정하였다. 각 파장에서 농도에 따른 흡광도는 다음과 같았다.

BSA 농도 (㎍/㎖) 파장(㎚)	0	50	100	200
600	0.055	0.056	0.084	0.182
650	0.031	0.096	0.134	0.203
700	0.055	0.105	0.127	0.220
750	0.029	0.102	0.133	0.287
800	0.026	0.123	0.137	0.234
850	0.012	0.059	0.077	0.183
900	0.024	0.065	0.072	0.197

Table 1. BSA 농도에 따른 각 파장 대에서의 흡광도

 

최적의 파장이 무엇인지 찾기 쉽게 하기 위해 그래프를 그려보았다.

 

Figure 10. BSA 농도에 따른 각 파장 대에서의 흡광도

대체적으로 750㎚와 800㎚ 파장에서 흡광도가 높게 나왔다. 실험의 오류로 인해 750㎚와 800㎚ 중 어느 파장이 최적인지 알 수 없기 때문에 두 파장대에서 모두 BSA 표준 곡선을 그려보았다.

 

Figure 11. 750㎚와 800㎚에서의 BSA 곡선

여기서 두 파장 중 어느 파장이 더 최적인지 알기 위해 R2 값을 비교해보았다. 800㎚의 R2은 0.9411이고 750㎚의 R2은 0.9827으로 1에 더 가깝다. 따라서 750㎚가 최적의 파장대임을 알 수 있다.

 

Figure 12. BSA standard curve

 

따라서 BSA 표준 곡선은 위 그래프와 같다. 증류수를 통해 UV/Vis spectrophotometer의 영점을 설정한 후, 미지 시료를 Lowry 반응 시킨 후에 분광광도계를 통해 UV/Vis spectrophotometer를 통해 흡광도를 측정하였더니, 0.223이었다. 이 값을 BSA standard curve의 추세선에 따라 계산한 미지 농도의 BSA시료의 농도는 150.5㎍/㎖이다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험에서 농도를 알고 있는 단백질 시료를 통해 최적의 파장대와 그 파장대에서의 BSA standard curve를 만든 후, BSA standard curve를 통해 미지 시료의 농도를 150.5㎍/㎖로 예측하였다. BSA standard curve를 도출하는 과정에서 750㎚와 800㎚에서 한 파장대의 흡광도가 확실히 우세하게 결과가 나오지 않아, 두 파장대 중 어느 파장대가 최적의 파장대인지 알아보기 위해 두 파장대 모두에서 곡선을 그려본 후, R2이 더 1에 가까운 750㎚에서 BSA standard curve를 도출했다. 

750㎚에서 50㎍/㎖ 농도에서와 100㎍/㎖ 농도에서 값이 예상보다 작아진 이유는 뚜렷하게 알 수 없지만, 큐벳의 표면에 이물질이 묻었거나, UV/Vis spectrophotometer 사용 중 빛이 세어 들어갔거나, 빛이 투과되는 곳에 먼지 같은 이물질이 묻어 있기 때문으로 예측해볼 수 있겠다. 이번 실험 중 몇 번의 실수가 있었다. 

첫 번째는 Figure 3.과 같이 pipetting에서의 실수로 인해 거품 같이 공기방울이 생겼다. 다음에 다시 피펫을 사용하게 되면 피펫 사용법에 대해 다시 한 번 정확히 숙지해 이 같은 현상이 나타나지 않게 해야할 것이다. 그리고 실험 농도를 아는 BSA 시료 중 200㎍/㎖의 큐벳이 흡광도 측정 중 쓰러지는 일이 발생했는데 다행히 미량의 시료만이 흘러 결과에는 영향을 미치지 않았다. 큐벳 같은 실험도구를 사용할 때 좀 더 주의해서 이 같은 일이 발생하지 않도록 해야 할 것이다.

 

참고 문헌

1. 식품의약품안전처, 단백질정량(로리)법 매뉴얼

2. 일반생물학실험서, 민철기, 라이프사이언스, 1999, p.43p~47

3. 화학대사전, 세화, 세화 편집부, 2001, 4권 p.84, p.183, 9권 p.906~907