[일반생물학실험]미생물 생장 측정 - colony count. 흡광도 측정

실험 목적

미생물의 세균수를 측정하는 방법을 알아본다.

실험 이론 및 원리

1. 배양연속성

1) 닫힌계

실험실에서 세균은 시험관 또는 플라스크에 들어있는 액체배지나 한천평판배지에서 자란다. 이렇게 영양분이 보충되지 않고, 노폐물이 제거되는 않는 환경을 닫힌계라고 한다. 닫힌계 조건 아래에서 개체군은 예측할 수 있는 형태로 그 수가 증가하다가 마지막에 감소한다. 이런 형태를 생장곡선으로 나타낼 수 있다. 회분계라고도 한다.

2) 열린계

영양분이 연속적으로 첨가되어져야 하고, 노폐물들도 제거되어 연속적인 생장의 단계로 세포를 유지할 수 있는 환경을 열린계라고 한다. 연속배양이라고도 한다.

 

2. 생장곡선

1) 지체기(유도기)

① 세균이 다른 배지로 옮겨지고 나면, 즉시 증가하지 않는다. 이 시기동안 세포들은 증식을 위해 요구되는 효소, 리보솜, 핵산과 같은 거대분자들을 합성하고, ATP의 형태로 에너지를 생성한다.

② 지체기의 길이는 어린세포일수록, 배지의 영양분이 풍부할수록 짧아진다. 영양분이 적은 배지로 가면 지체기는 길어지는데, 이는 세포가 새로운 배지에서 구할 수 없는 구성성분을 합성하기 위해 효소를 만들기 시작해야 하기 때문이다.

 

2) 대수기(지수기)

① 세포가 일정한 비율로 분열하고, 세포의 수가 시간 당 일정하게 증가한다. 세대시간이 측정되는 기간이다. 의학적으로 중요하다. 왜냐하면 세균이 항생물질과 다른 화학물질에 가장 민감하기 때문이다.

② 대수기 초기 단계 : 모든 세포가 증가하는 방향으로 생장. 단백질과 핵산의 기초물질인 아미노산과 뉴클레오티드 생산. 일차 대사물질(활발한 증식을 하는 이 기간 동안 합성된 화합물)-생장에 필요한 화합물뿐만 아니라 노폐물도 포함. 몇몇 일차 대사물질을 맛을 내는 물질과 식품첨가제로써 상업적인 가치가 있음.

③ 대수기 후반 단계 : 세포가 정지기로 전환되어 감. 영양분의 결핍과 노폐물의 축적 등의 닫힌계에서 필연적으로 나타나는 다수의 원인으로 일어난다. 내생포자를 형성할 수 있는 세포 : 포자형성과정 시작. 포자 형성 불가능한 세포 : 기아상태 대비를 위해 몸 감싸기. 모양을 더욱 둥글게, 유해한 화학물질과 방사선에도 내성의 정도 증가. 세포벽과 세포막의 조성 변화. 이차 대사물질(환경의 변화로 합성된 다른 종류의 효소와 단백질) - 상업적으로 가장 중요한 이차물질은 항생제이다. 다른 미생물들을 죽이거나 생장을 억제함.

 

3) 정지기

에너지와 영양분 공급이 고갈되었을 때, 들어가는 단계.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) spectrophotometer. cuvette.

2) 1시간 간격으로 TSB배지에 배양된 대장균(Escherichia Coli.)

3) 실험 배지

기본배지(2종류). 많은 종류의 미생물을 배양하는데 사용됨.

① TSA(Tryptic soy agar) : 고체배지. 주로 초기 성장 배지로써 사용. 다음과 같은 목적으로. 콜로니 형태 관찰. 순수 배양시킬 때. 생화학 테스팅에 사용하기 위한 미생물을 충분히 성장시키기 위해.

② TSB(Tryptic soy broth) : 액체배지. 특정 생화학 실험에서 많은 수의 박테리아를 만들기 위해 사용. 특히 세균의 수를 결정할 때 사용됨.

실험 여건 상, 미리 배양한 미생물을 사용하였고, 분광 광도계 사용법만 간단히 알아보았다.

실험 방법

1. 실험 과정

1) Spectrophotometer 4㎖ cuvette에 배양된 대장균을 넣는다.(1시간, 2시간, 3시간, 4시간 - 4가지)

2) 결과값(ABS)을 확인한다.

실험 결과 및 토의

1. 결과 data

600λ(㎚)

배양시간(HR)	ABS
0	0.0004
1	0.0420
2	0.1378
3	0.1013
4	0.6492

 

2. 실험 고찰

대조군(0시간) 값을 보았을 때, 0의 값이 아니라서 기계에 오류가 있거나 혹은 대조군에 대장균이 섞여 있을 가능성이 있음을 알 수 있다. 시간이 갈수록 값이 증가하는 것으로 볼 때, 대장균이 증가하고 있음을 알고 있다. 다만 3시간 배양한 시험관의 값이 떨어져서 애매하긴 하나, 4번째에서 눈에 띠게 증가한 것으로 볼 때, 2시간에서 4시간 사이가 대수기임을 알 수 있다.