[식품위생학실험]식중독세균 동정실험 : 생화학 테스트 II (API kit와 VITEK system 이용)

실험 목적

1. APIⓇ 20E, VITEKⓇ 2 system의 기본 원리를 이해한다.

2. 생화학적 특성을 이용한 식중독세균 동정 실험법을 익힌다

실험 이론 및 원리

1. 실험 배경

1) 건조된 기질을 함유한 API 스트립에 균을 배양하면 생성 산물에 의해 색이 변화하거나 보조시약의 첨가로 색이 변화되며 이를 통해 식중독균을 동정할 수 있다.

2) Vitek은 균액주입, 배양, 판독이 동시에 이루어지는 전자동화 장비로써, 초미량의 각종 건조 배지 및 생화학적 반응물이 들어있는 64개 마이크로웰이 있는 플라스틱 카드를 사용하여 미생물을 동정, 분석한다.

 

2. API test

API kit는 biochemical test, assimilation test 그리고 fermentation test를 이용한 동정법이다. 

Biochemical test는 saline 용액에 시험균을 현탁하여 건조된 기질이 들어있는 kit의 cupules에 접종하여 배양 후 발색시약을 첨가하여 물질의 대사유무를 색의 변화로써 판정하는 방법이다. 

Assimilation test는 최소배지에 현탁한 시험균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 kit의 cupules 에 접종 배양한 후 시험균이 이들 당을 이용할 수 있는지 여부를 탁도 변화로써 판정하는 방법이다. 

Fermentation test는 당으로부터 산을 생성하여 pH의 변화로 판정하는 방법이다. 

이 중 본 실험에 사용하는 API 20E은 장내세균, Gram (-)균을 동정할 시에 사용하는 실험방법으로서 23종류의 biochemical test를 이용한다.

 

3. Vitek

Vitek은 미생물의 생화학적 특성 즉, 효소반응, 당분해 반응 등을 자동적으로 측정하여 전체의 library와 비교하여 미생물을 동정하는 기기이다. 동정하고자 하는 균의 간단한 특성을 조사하여 적합한 card를 선정하여 사용하면 된다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 기구 : pipette 1000P, 100 or 200P, 멸균 pipette tip, 백금이, 백금선, hazard bag, 70% 알코올 분무기, 알코올 램프

2) 기기 : Autoclave, clean bench(a laminar flow biosafety cabinet), incubator, vitek 탁도계

3) 실험복, latex glove

4) 시료 : A, B, C, D, E (5개 bacteria sample)

5) 시약 : API 20E kit, suspension medium, TDA, JAMES, VP1+VP2, NIT1+NIT2, TSYEA, Pippet(200㎕), yellow tip, 알콜램프, 0.45% saline, GN card, GP card

6) APIⓇ 20E

멸균 건조된 배지와 기질이 들어있어 20가지의 생화학 테스트를 할 수 있는 표준화된 strip을 사용하는 APIⓇ 20E는 장내세균과에 속하는 그람음성 간균과 그 밖의 그람음성 간균의 극히 일부를 동정하는 간이 kit 이다. 표준화된 strip으로 20가지의 테스트를 수행할 수 있으며, 추가적인 테스트를 합해 최대 23가지의 생화학적인 시험으로 동정할 수 있다.

7) VITEKⓇ 2 system

건조된 기질을 함유한 VITEK reagent card를 사용하는 VITEKⓇ 2 system은 균액 주입, 배양, 판독이 동시에 이루어지는 전자동화 장비로써, 초미량의 각종 건조 배지 및 생화학적 반응물이 들어있는 64개 microwell이 있는 플라스틱 카드를 사용하여 미생물을 동정, 분석한다.

 

 

실험 방법

1. API 20E

1) Suspension medium에 잘 분리된 몇 개의 colony를 취한 후 희석한다.

2) 균액을 튜브에 접종한다.

- CIT, VP, GEL은 큐플까지, 나머지는 큐플을 제외하고 튜브만 채운다.

- ADH, LDC, DOC, H2S, URE는 혐기적인 조건을 만들어 주기 위해 mineral oil로 큐플을 채운다.

3) 인큐베이션 박스의 뚜껑을 덮고 37℃에서 24시간 호기배양한다.

4) 보조시약을 첨가하고 5분 이내에 판독표에 따라 읽는다.

- TDA test(TDA), IND test(JAMES), VP test(VP1+VP2), test(GLU tube에 NIT1+NIT2)

5) 양성일 경우 더하여 프로그램에 입력하여 결과를 얻는다.

 

2. Vitek

1) 단일 colony를 취하여 0.45% saline에 희석한다. (McF 0.6)

2) Gram-negative bacilli는 GN card, Gram-positive bacilli는 GP card를 사용한다.

3) Vitek 기기에 연결된 컴퓨터에 바코드를 입력하고 기기를 사용하여 동정한다.

 

3. Software & Workflow

1) Enter Manage Cassette View를 선택한다.

2) Creat New Virtual Cassette를 선택한 후 스캐너를 이용해 카세트 ID, 카드 바코드를 입력하고 저장한다.

3) 카세트를 필러에 장착한 후 Vitek 화면에서 “Start Fill"의 시작 버튼을 선택하면 탁도를 맞춘 균액이 카드로 주입된다.

4) 필링이 완료되면 Filter의 문을 열고 loader의 잠긴 문이 열리는 것을 확인한 후 로더의 문을 연다. 카세트를 Casette load station에 장착하면 로더의 문이 잠기며, 바코드, 카드를 밀봉한 후 자동으로 인큐베이터에 장착된다.

실험 결과

1. API 20E

5개의 sample(A~E) 중 API test에 쓰인 sample은 장내세균이자 Gram (-) 균인 A, B, C 세 가지였다. 그 중 실험은 B를 가지고 실험을 진행하였으나 실험 종료 후 완성된 키트가 바닥으로 떨어지는 바람에, 이를 가지고는 제대로 된 결과를 관찰할 수 없다는 판단 하에 같은 sample로 실험을 진행한 2조의 결과를 토대로 리포트를 작성하기로 하였다.

그림 1 시간 지나기 전

그림 2 시간 지난 후

그림 3 보조 시약 투여 후

 

보조시약 투여 전 후를 보면 눈에 띄는 차이는 없으나 일부 kit에서 색의 변화가 일어났음을 알 수 있다.

그림 4 결과지

그림 5 API 사이트에서 확인한 동정 결과

결과 판독표를 참고하거나 또는 기준이 되는 실험결과 대조 그림과 직접 비교하여 각 키트 별 양성/음성을 판별해 내고 양성인 것들의 점수만 그룹별로 따로 취합하여 API 웹사이트에 수치를 기록한 다음 최종 결과를 기다리면 그림 5와 같이 Salmonella spp.(99.9%의 확률)로 동정되었음을 확인할 수 있다.

 

2. Vitek

sample E를 가지고 Vitek 실험을 진행하였다. 그러나 API 20E test에서는 sample B를 동정하고자 했기 때문에 이에 대한 신뢰도 비교를 위해서 sample B의 Vitek 결과도 함께 첨부하기로 한다.

그림 6. sample E의 Vitek 실험 결과

그림 7. sample B의 Vitek 실험 결과

우선, Sample B를 가지고 한 Vitek 실험 결과부터 보면 API 20E test와 동일한 결과가 나왔음을 알 수 있다. 그림 7의 Selected organism 부분을 보면 Salmonella group 으로 동정되었음을 확인할 수 있다. 그림 7 아래 부분의 “Analysis Organisms and Test to Seperate"을 보면 예상되는 균종명이 나열되어 있는데, 이는 Vitek 만을 가지고는 균의 최종 동정이 불가능하기 때문이다. Serological test(혈청학적인 실험)를 통해서 나머지 동정이 가능하다.

한편 그림 6을 통해서는 Sample E의 실험 결과의 확인이 가능하다. 최종 결과는 Staphylococcus aureus 로 동정되었으며 확률은 99%이다. 신뢰도(Confidence)를 보면 Excellent idenfication으로 기재되어있는 것으로 보아 매우 잘 된 실험이라고 할 수 있겠다.

토의 사항

1. 실험 고찰

API 20E test와 Vitek을 이용하여 식중독 세균 동정실험을 진행해 보았다. API 20E을 통해서 sample B가 salmonella group임을 알 수 있었으며 이는 Vitek 실험을 통해서 한 번 더 확인되었다. 다만, sample B의 최종동정을 위해서는 혈청학적인 테스트를 거쳐야 함을 알 수 있었다. 그리고 sample E의 경우에는 Vitek 테스트만을 시행하였는데, 그 이유는 Gram positive 균인 E의 경우 Gram negative 균만을 대상으로 하는 API 20E 실험에 이용될 수 없기 때문이다. Sample E는 Vitek을 통해서 Staphylococcus aureus 로 동정되었다.