[혈액학실험]Wright & Geimsa 염색

염색

일반적으로 보통 염색은 표본을 메탄올로 고정시킨 후 염기성 색소와 산성색소가 포함된 염색액에 염색하는 방법

Wright 염색

라이트염색은 동일액을 고정염색을 하기 때문에 간편하며 신속하게 염색된다. 과립구의 모든 과립을 명료하게 염색해 내는 장점이 있으나, 때로 너무 강하게 염색되는 경우가 있다. 단구의 아즈르과립도 거칠게 너무 염색되는 경우가 많다. 

핵의 염색성은 약간 나쁘다. 비교적 단시간으로 염색되어 실용적이기 때문에 보급되어 있으나, 표본면으로의 색소침착이나 염색얼룩이 생기는 경우도 있다. 염색액이 약간 불안정하며 조제후 일정 숙성기간내의 것을 사용할 필요가 있는 등의 결점도 있다.

 

methylene auer와 eosin 을 포함한다. 메탄올이 97% 포함되어 있으므로 이 액은 고정과 동시에 염색이 되기 때문에 염색과정이 간편하다.

 

1. 실험 시약

① wright 용액

② 완충액의 조제 (pH 6.4~ 6.6)

A액 : KH2PO4 9.07g을 증류수에 넣어서 용해시키고 1L로 만든다.

B액 : Na2HPO4 9.47g을 증류수에 넣어서 용해시킨 다음 1L로 만든다.

→ 이 두 용액을 혼합하여 사용한다.

 

2. 실험 방법

① 충분히 건조된 도말 slide를 표본 걸개에 올려 놓는다.

② Wright용액 약 2㎖를 slide glass 전체에 퍼지도록 떨어뜨리고 4~5분간 염색을 한다. (고정과 염색이 동시에 일어난다. )

③ 희석 인산완충액(pH6.4)을 Wright용액과 동량(2㎖)을 조심스럽게 중첩 시켜 액이 흘러넘치지 않도록 입으로 불어서 Wright액과 잘 섞이도록 한다.

④ 실온에서 4~5분간 염색한 후에 흐르는 물로 충분히 씻어내고 염색 뒷면을 잘 닦아 건조시킨다.

Giemsa 염색

말초혈액세포나 골수세포의 염색에 자주 사용된다. 방법은 슬라이드유리에 바른 표본에 약 30초 메타놀고정을 해 건조시킨다. 김자희석액(김자원액을 증류수 1㎖에 한방울의 비율)을 표본에 충분량 올려 놓고 15~30분 염색한 다음, 물에 씻어 건조시킨다.

Giemsa원액은 아주르 II(메틸렌블루와 메틸렌아주르<아주르I>의 등량 화합물)와 아주르II에오진(메틸렌블루에오진과 메틸렌아주르의 혼합물)을 가한 글리세린메탄올용액이며, 이 희석액을 사용하여 염색을 하는 방법이다. 

염색은 메탄올 고정(固定) 후, Giemsa희석액을 얹는다. 지적 pH는 6.4이고, 염색기간은 20~30분이지만, 온도가 높으면 짧고 낮으면 오래 걸린다. 핵은 잘 염색되나 과립 특히 중성호구성 과립(顆粒)의 염색이 불충분하다.

 

1. 실험 시약

① giemsa 용액의 제조

Giemsa powder 0.5g, Glycerin 33㎖ → 55~60℃되는 water bath에서 가온하면서 녹이고 순수 메탄올 33㎖를 섞고 혼합 후 여과하여 갈색병에서 숙성시킨후 사용한다.

 

② 인산완충액은 Wright용액의 것을 사용한다.

③ Working Giemsa용액 : Giemsa stock용액 1㎖에 인산완충액 15㎖ 를 혼합하면 된다.

 

2. 실험 방법

① 도말표본을 1~3분 동안 고정시킨 후에 액을 버리고 건조시킨다.

② 인산완충액 1 ㎖에 giemsa액 1~1.5방울의 비율로 섞은 염색액을 표본 위에 올려놓는다. (표본 1장에 약 3㎖). 일단 희석한 염색액은 즉시 사용하는 것이 좋다.

③ 실온에서 15~30분간 염색 후 흐르는 물로 충분히 씻어내고 건조시킨다.

Wright-Giemsa 염색

라이트염색에서는 세포질이 잘 염색되며 과립도 깨끗하게 나오는데 때로 핵의 염색이 좋지 않은 경우가 있으며, 그 때에는 라이트–김사 2중염색으로 하면 좋다. 방법은 라이트염색을 하며, 수세후 마르는 것을 기다리지 않고 김사희석액을 가해서 5~10분간, 후염색 한다. 수세, 건조후 경검한다.

라이트–김사염색은 일본의 실정에서는 가장 우수한 것으로, 혈액상, 골수상, 세포진등 건조고정의 표본에 이용된다. Wright 염색 후에 다시 Giemsa염색을 추가하는 것으로 서로의 결점이 보완되므로 염색성이 양호한 핵과 과립을 얻을 수 있다.

 

1. 실험 방법

① 먼저 Wright 염색을 한다. 단 Wright 액을 올려놓는 시간은 3~5분으로 하고 완충액을 먼저 놓고 나서 염색시간은 2~3분으로 하거나 혹은 곧바로 물로 씻어도 좋다.

② 다음에 Giemsa 염색액으로 10~20분간 염색하고 물로 씻어서 건조시킨다.

 

실험 결과 및 토의

1. 실험 고찰

실험을 하기전에 채혈을 해야한다. 채혈을 하기 전에 주사기에 바늘을 꽂고 바늘의 방향을 주사기의 눈금이 써진 곳의 방향과 함께 조절하며 정정하고 채혈 받을 사람의 팔을 핏줄이 잘 보일 우 있도록 고무줄로 압박을 주며 세게 묶고, 채혈 받는 사람이 팔에 핏줄이 더 잘 보일 수 있도록 팔의 근력을 키워주면 겉으로 가만히 있었을 때 보이지 않던 핏줄도 튀어나오며 보여 진다. 그러고 나서 손으로 한번 더 살짝 만져보며 채혈을 해도 되는 혈관인지 확인한 후 알콜솜으로 채혈 할 부위를 닦아내고 주사기 바늘의 사선으로 깎인 면이 하늘을 보도록 바늘을 찌른다.

혈관을 뚫고 들어가는 톡하는 느낌이 난다며 설명 해주었는데 첫 채혈에서는 그런 느낌이 나지 않았다. 또한 제대로 채혈이 성공했다면 바늘을 꽂자마자 주사기 끝에 피가 맺혀야 하지만 첫 채혈에서는 주사기 끝에 피가 맺히지 않았다. 잘못 찌른 것 같았다. 채혈의 잘못된 점이 무엇인가를 생각해보면, 혈관을 잘못 찾았거나 주사기의 45도 각도로 눕혀서 주사기 바늘의 사선으로 깎인 면이 하늘을 향하도록 찌르라고 하였지만 첫 채혈의 긴장과 다른 사람의 몸에 주사기를 찌는 다는 것의 압박감 때문에 주사기를 찌르기 전에 채혈할 부위를 확인했지만 긴장감으로 인해 손을 떨어 주사기를 다른 부위에 찔렀는지도 모르겠다. 그리고 채혈 한 뒤 친구들이 채혈 부위를 누르고 있었는데 계속 피가 난다, 채혈한 부위에 멍이 들었다. 하는 얘기가 많았다. 왜 그런 것인가 의문이 들어 조금 알아보았다.

일단 채혈 뒤 그 부위를 누르고 있는 이유는 지혈을 하기 위해서다. 보통 살짝 까지거나 베었을 때는 그 정도로 누르지 않아도 지혈이 된다. 그 이유는 몸의 platelet이 혈액을 응고 시켜주기 때문이다. 또한 그런 상처는 모세혈관이 손상 받아 나오는 것이기 때문에 쉽게 응고가 가능하기 때문이다. 하지만 채혈 시에는 정맥을 관통해서 직접 뽑는다. 정맥은 모세혈관보다 혈압도 높고 혈류량도 많기 때문에 platelet에 의한 자연적인 지혈이 힘들다. 그래서 인위적으로 그 부위를 막아 지혈에 도움을 주는 것이다. 이런 방법은 직접지혈법으로 압박법에 속한다.

압박법은 지혈에 가장 기본적인 것으로 균등하게 5~10분정도 압박하는 것이 적당하다. 그러나 이번 실습 시 보면 1분정도만 지혈하고 때버리고 이런 경향이 많았기 때문에 계속 피가 나온다는 얘기가 나왔었던 것 같다. 만약 조금 더 빨리 지혈은 하고 싶다면 국소거양법을 사용한다. 국소거양법이란 상처 부위를 심장보다 높은 위치에 위치시키는 것으로 이렇게 하면 혈액이 흐르는게 늦춰져 지혈이 더 빠르게 된다. 이 방법은 거의 모든 지혈 시 사용된다.

다른 지혈법에는 간접압박법 및 붕대 지혈법이 있다. 간접압박법은 지혈대를 이용하는 것으로 다친 부위보다 더 위를 지혈대를 사용해 묶어서 혈액의 흐름을 차단하는 방법이다. 붕대를 사용할 시에는 꼭 멸균된 붕대를 사용해야 하며, 붕대특성상 묶으면 상처에 더 큰 손상을 줄 수 있으므로, 거즈를 상처부위에 덮은 뒤 붕대를 이용하여 묶는 것이 중요하다. 이렇게 우여곡절 끝에 채혈한 피는 항응고제가 담겨있는 EDTA 진공관에 바늘을 꽂으면 저절로 피가 이동된다.

피를 EDTA에 옮기고 나서 흔들어 준 후 이제 염색을 하기위해 혈액도말을 해야 한다. 혈청 분리관으로 EDTA에 담긴 혈액을 담아 slide glass위의 한 쪽 끝에 기포가 생기지 않게 한 방울 떨어뜨린 후 다른 slide glass의 모퉁이로 혈액을 펴준다. 혓바닥모양으로 한쪽 끝이 두꺼웠다가 반대방향 끝으로는 얇아지는 성상을 보이도록 하는 것이 이상적이다. 또한 혓바닥모양으로 혈액을 펴주면서 ideal zone이 뚜렷하게 보이는 것이 올바르게 도말을 한 것이라고 볼 수 있다.

ideal zone이 도말 염색 후 현미경 관찰에서 혈액을 잘 관찰 할 수 있는 부분이다. 그런데 막상 도말을 해보니 말은 한번에 혓바닥모양이 쉽게 나올 것 같았지만 조원 전체가 다 함께 도말을 했지만 막상 실습에 쓸 수 있는 올바른 도말이 된 slide glass는 열댓개 안으로 나왔다. 정말 요령이 필요한데 아직까지는 요령을 파악하지 못해 아쉬웠다. 그렇게 힘들게 한 도말 중 ideal zone이 잘 나온 것을 따로 솎아 내어 혈액을 건조시켰다. 

혈액이 잘 마른 slide glass를 표본 걸개에 올려놓고 혈청분리관으로 2㎖를 혈액 전체를 다 덮을 수 있도록 wight용액을 도포한다. 그리고 5분을 기다린다. 이 때 고정과 염색이 동시에 이루어 진다고 들었다.

그리고 인산완충액도 Wright용액과 같은 양인 2㎖를 조심스럽게 중첩시켜 액이 흘러넘치지 않도록 입으로 불어서 Wright용액과 잘 섞이도록 한다. 그것을 실온에서 5분 염색을 시킨다. 염색한 후에는 혈액이 묻어있는 곳의 반대편으로 뒤집어서 약하게 흐르는 물에 10분 정도 씻어낸 후 건조시킨다. 그리고 나서 현미경 관찰을 하였는데 적혈구는 과립모양으로 잘 보였다. 염색도 잘 되어서 동글 동글하게 모양이 뚜렷하게 보였다. 하지만 백혈구는 보이지 않았다.

giemsa염색을 하기 위해서 Wright와 마찬가지로 혈액이 잘 마른 도말 표본을 표본 걸개에 올려놓고 3분 고정시킨 후에 액을 버리고 건조시킨다. 인산완충액과 geimsa액을 1:1.5의 비율로 섞은 염색액을 표본 위에 올려놓는다. 실온에서 30분 염색한 후에 흐르는 물에 slide glass를 뒤집어서 10분 수세한 후 건조시킨다. 그리고 나서 현미경 관찰을 한다. 현미경 관찰을 하니 풍선모양의 것들이 엄청 많고 그 사이에 하나의 파랗게 염색 된 동그란 과립이 보였다. 이것이 백혈구 인 것 같다. 현미경 관찰에서 찾기 힘들었다.

그리고 마지막으로 Wright-Giemsa 염색을 하였는데, 먼저 혈액이 잘 건조된 도말표본을 표본걸개에 올려놓고 앞에서와 마찬가지로 Wright염색을 한다. 단 Wright액의 도포시간을 5분으로 하고 완충액을 도포하고 나서 염색시간을 3분으로 하거나 도포 하고 나서 곧바로 물로 씻는다. 다음에 Geimsa염색액으로 15분간 염색하고 이 또한 slide glass를 뒤집어서 10분 동안 물로 수세한다. 건조시킨 후 현미경 관찰을 한다. 그러나 현미경 관찰에서 실험 결과 아무 이득이 없었다. 무엇인가 염색 과정에서 잘못 된 것 같았다. 

수세시간을 너무 오래해서 혈액도말이 다 씻겨 나갔거나, 혹은 수세할 때 잘못 뒤집어 수세해서 다 씻겨 내려갔거나, 염색시간을 너무 오래해서 염색약이 뭉쳐서 현미경으로 관찰이 되지 않는다던가, 반대로 염색시간을 너무 적게 해서 염색이 되지 않아 현미경관찰이 되지 않거나 아니면 도말을 잘못해서 혈액이 다 뭉쳐서 굳었다던가 하는 염색실패의 여러 가지 이유를 생각해 보았다. 다음에 또 염색할 기회가 생긴다면 그때는 시간적 여유를 갖고 도말의 경우의 수를 여러 가지로 해서 수세시간, 염색시간, 염색약의 양 등의 오차를 두고 재실험을 해보면서 경우를 체크하면서 하면 실험이 성공적으로 끝날 수 있을 것 같다.