[미생물실험]미생물 배지 만들기, 멸균 처리법

실험 목적

미생물이 자라는데 필요한 배지를 만드는 방법을 습득하고 이때 쓰이는 멸균조작법을 익힌다. 그리고 배지와 미생물의 성장과의 관계를 알아보고, LB배지를 만들어 보자.

실험 이론 및 원리

1. 배지는 화학적 조성에 따라 합성배지와 복합배지로 나눌 수 있다.

1) 합성배지(synthetic medium) : 성분명확배지(defined medium). 모든 화학적 조성을 알고 있는 배지를 말한다.

2) 복합배지(complex media) : 성분불명확배지. 배지 안에 들어가 있는 농도나 조성을 모른다. 이 복합배지에는 펩톤 그리고 추출물과 같이 그 성분을 정확히 할 수 없는 것이 포함된다. 고체배지를 만들 때 넣어주는 것은 Agar(한천)이다.

 

2. 용도에 따른 배지의 종류

1) 일반배지 - 일반배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육 할 수 있도록 제조된 배지 로 세균용으로는 Nutrient broth, Nutrient agar를 곰팡이용으로는 감자한천 배지 등이 이용된다.

2) 특수배지 - 특수배지는 선택배지, 판별배지, 증식배지, 생화학적 시험용 배지 등이 있 다.

① 선택배지 : 목적하는 미생물의 생육을 증진시키고 다른 미생물의 생육을 억제되도록 만 들어진 배지로 토양, 병든 조직에서 목적하는 균을 분리 배양하기 위해서 많 은 선택배지가 고안되었다.

② 판별배지 : 미생물의 생화학적 성질을 이용하여 여러 미생물이 혼재 되어 있는 곳에서 목적으로 하는 미생물을 판별, 확인하기 위해 만들어진 배지이다.

③ 증식배지 : 보통배지에서는 생육이 잘 안 되는 미생물이나, 생육이 나쁜 미생물의 생장, 증식을 촉진시키는 것을 목적으로 하는 배지이다.

④ 생화학적 성질 조사를 위한 배지 : 세균의 분류, 동정을 위한 배지.

 

3. 멸균

모든 생존 가능한 미생물을 완전히 제거 또는 사멸하는 것. 무생물체에 사용한다.

미생물의 사멸양상 : 미생물이 독성물질에 노출된 시간에 대해 집단의 개체 수를 로그그래프고 그리면 직선으로 나타난다. 세균은 정상 상태에서 그 세균이 자랄 수 있는 새로운 배지에 접종했을 때 분영하지 않으면 죽은 것으로 정의한다.

1) 습윤멸균 : 고온, 고압 수증기를 포화시킨 고압멸균기(Autoclave)를 사용하여 내생포자(Endospore)를 포함한 모든 미생물을 사멸시키는 것을 말한다. 내열성 포자는100℃에서도 생존 가능하기 때문에1.1㎏/㎠(15 lb/in2)의 증기압을 이용. 기내 온도를121℃로 유지하여 멸균시킨다. 고온에서 변질, 분해되지 않는 배지나 주사기, 피펫 등의 멸균에 사용하며, 보통 121℃에서10~15분 멸균한다.

2) 건열멸균 : 가열된 공기를 이용하는 방법으로 증기에 비해 열전도율이 낮아 160℃에서 적어도 1시간 이상 가열하며, 고온에서 견딜 수 있는 면전을 한 시험관이나 플라스크 등의 멸균에 사용하며 주로 유리.

3) 여 과 : 공경이 약 0.2~0.45μm의 멸균된 여과지를 사용하여 제거하는 방법으로 가열에 의해 영향을 받는 물질을 함유한 용액의 멸균에 사용한다. 액체배지만 가능하다.

실험 기구 및 시약

1. 실험재료

1) 비커, 긴 플라스크, 삼각플라스크, Oil paper, 저울, 알루미늄 호일

2) petri dish, 알코올램프, 시약스푼

3) H2O (증류수) 100㎖, Agar 20g, Glouse 90g

4) Tryptone 10g : 트립톤은 단지 우유 단백질을 분해하고 나온 아미노산이다. 아미노산을 주기위해서 많은 배지에 tryptone이 들어간다. 아미노산으로 이루어져 있고 홀로 배지 조성이 되거나 하지는 않는다.

5) Yeast Extract 5g : 이것은 Yeast를 갈아낸 것이다. 효모는 vitamin이 많이 때문에 미량의 vitamin을 필요로 할 때 사용하고 있다. 또한 단백질, 아미노산도 풍부하므로 다양하게 활용할 수 있다. 균의 성장이 더딜때 아주 소량 넣어주면 성장을 촉진 할 수 있으며 세균이 자라기에 충분한영양분이 있어 홀로 영양배지로 사용될 수 있다.

6) NaCl 10g : 소금은 미생물 생장에 직접 쓰이기보다는 삼투압 유지에 쓰인다

7) 클린벤치(Clean bench) : 실내공기는 1차 필터에서 큰 먼지가 걸러지고 2차필터를 통과하면서 곰팡이와 세균이 걸러지기 때문에 이 공기가 흐르는 앞에서는 무균작업을 할 수 있다. 클린벤치에는 자외선등, 형광등, 송풍기, 전기콘센트 등이 설치되어 있다.

실험 방법

1. LB 배지 만들기

1) 증류수 1리터에 Tryptone 10g, Yeast extract 5g, Nacl 10g을 넣고 녹인 후, Agar를 15g 첨가한 후, 121도, 15분간 가압멸균한다.

2) 60℃로 식은 배지를 Petridish에 적당량 붓는다. (dish 하나당 25~30㎖)

3) 배지를 굳힌다

4) 고체배지가 다 굳으면 lab으로 싸주거나, parafilm으로 감아준 다음, 4도에서 보관한다.

실험 결과

1. 결과 분석

고체배지가 다 굳었다.

토의 사항

1. 실험 고찰

배지를 만들 때 주의해야 할 것은 만들고 난 배지를 페트리 디쉬에 부을 때 중간부터 부어야 가장자리에 미생물들이 증식되지 않는다는 것이다. 그리고 멸균이 된 상태에서 배지를 부어야 한다.

멸균 처리법을 통해 미생물 실험 시 멸균이 얼마나 중요한 지에 대해 생각할 수 있었다. 공기 중에는 수많은 미생물이 존재하고, 필요한 미생물만을 배양하기 위해서는 실험 전에 멸균 처리법이 매우 중요하다.

멸균 시 알코올램프를 켜둠으로써 공기의 흐름을 변화시켜 미생물로부터 오염되는 위험을 방지할 수 있다

참고 문헌

일반미생물학 7판, 라이프사이언스, Willey외 2인, 2008, p.107~110