[미생물실험]배지 멸균

실험 목적

미생물 실험은 적당한 배지를 준비하여, 목적으로 하는 미생물 만을 순수 배양한 동일 집단을 가지고 연구한다. 이 때 실험실 에서 여러 가지 조건으로 배지가 오염되어 원하는 실험 결과를 얻지 못하는 것을 막기 위해 멸균을 한다.

실험 이론 및 원리

1. 배지

배지란 적당량의 영양성분을 혼합해서 미생물을 생존시키고 지속적으로 증식시키기 위해서 인공적인 증식환경이 만들어진 상태를 말한다. 모든 미생물이 에너지, 탄소, 질소, 인, 황, 무기질 공급원을 필요로 하지만 미생물마다 요구되는 영양소가 다르기 때문에 배지 조성도 다 다르다. 배지의 주요 성분으로는 펩톤, 육즙성분, 효모 추출물, 한천, 젤라틴 등이 있고, 기타 목적에 따라 carbohydrate, buffer, 지시약, 억제제 등이 사용된다.

 

2. 배지의 종류

1) 배지의 성분에 따른 분류

① 천연배지 : 단백질의 가수분해물, 동물조직의 침출물 등 화학적 성질이 분명하지 않은 물질을 혼합하여 만든 것, 세균의 중식, 분리 배양에 널리 사용된다.

② 합성배지 : 화학적 성질이 분명한 것으로 합성하여 만든 배지로써 세균의 생화학적 성상검사, 균체 성분, 세균의 대사연구에 주로 사용한다.

③ 반합성배지 : 고분자 물질은 들어 있지 않으나 단백질의 완전 가수분해물을 주성분으로 한 배지

 

2) 형태에 따른 분류

① 액체 배지 : 배지 내에 agar 성분이 들어있지 않은 배지로 액체 상태이다.

② 고체 배지 : 배지 내에 agar 성분이 약 1.3~1.5% 함유된 배지로 고체 상태이다. 사용목적에 따라 다음과 같이 분류한다.

a. 평판 배지 - 배양접시에 약 4mm 두께(15~20mL) 정도 넣어 굳힌 것이 평판배지인데 주로 세균의 분리배양, colony의 관찰, 용혈능 관찰 등에 이용된다.

b. 고층 배지 - 시험관을 세운 상태로 배지를 굳힌 것으로 반유동배지이며 주로 세균의 성상검사 균주의 보존, 세균의 운동성 등에 이용된다.

c. 사면 배지 - 시험관에 배지가 약 45〫〫〫˚ 경사가 되도록 굳힌 것으로 세균의 증식, 보존 등에 쓰인다.

d. 반사면 배지 - 고층배지의 상부 1/3 정도를 경사지게 만든 것으로 세균의 생물학적 성상검사 등에 쓰인다.

③ 반고체 배지 : 배지 내에 agar 성분이 약 0.3~0.5% 함유된 배지로 반고체상태를 이룬다. 이 배지는 세균의 운동성 관찰과 세균의 보존 및 수송에 이용된다.

 

3) 사용목적에 따른 분류

① 증식용 배지 : 여러 종류의 적당량의 영양소를 함유한 배지로써 균종에 대한 선택성은 없다. 세균의 증식, 순수배양, 보존 등 특수한 목적이 아닌 일반적인 배양에 주로 사용한다.

② 증균용 배지 : 분변과 같이 많은 세균의 혼합된 경우 특정한 균종만을 다른 균종보다 빨리 증식시켜 분리배양이 쉽게 되도록 만든 배지이다.

③ 선택 배지 : 두 종 이상의 세균이 혼합되어 있는 검체에서 원하는 세균을 분리하는데 사용하는 배지이다. 이 배지에는 색소나 중금속, 화학약품, 항균제 등 원하지 않는 균을 억제시키는 억제제가 들어있다.

④ 감별배지 : 순수 배양된 세균의 특정한 효소반응을 보통 정성적으로 확인하고 균종의 감별과 동정을 목표로 하는 배지이며 이런 배지는 반응 물질과의 반응을 판정하기 위해 지시약이 함유되는 경우가 있다.

⑤ 수송용 배지, 보존 배지 : 분리 배양하기까지 시간이 늦어지거나 원거리로 재료를 수송하거나 할 때 재료중의 세균이 과증식하거나 사멸하지 않도록 고안된 배지이다.

 

3. 멸균(sterilization)

미생물의 배지나 실험기구를 무균 상태로 유지하기 위해서 포자를 포함한 미생물을 제거하거나 사멸시키는 과정이다. 즉, 열, 증기, 자외선 또는 전기적 에너지 등 물리적인 방법에 의하여 모든 종류의 미생물을 멸균하는 방법이다.

1) 건열멸균(Dry heat sterilization)

건열에 의하여 미생물을 산화 또는 탄화시켜서 멸균하는 방법이다. 주로 유리기구, 오일, 부날 등의 멸균에 이용한다. 멸균하려고 하는 재료를 전기용 건열멸균기에 넣어 온도를 높여 160℃가 되면 열원을 고정시켜 30분간 가열을 계속하던가, 180℃까지 온도를 높여 곧 열원을 끈다. 검사기구는 산, 알칼리 및 기타 불순물이 남아 있지 않도록 청결하게 한 것을 사용한다.

 

2) 화염멸균(Flaming sterilization)

멸균하고자 하는 물체를 불꽃에 직접 접촉시켜 표면에 붙어있는 미생물을 태워서 없애는 방법. 시험관 입구, 솜마개 입구 등은 일시적인 화염멸균을 사용한다.

 

3) 습열멸균(Moist heat sterilization)

① 자비소독(Boiling)

끓는 물에 약 15분 정도 넣어둔다. 이 방법으로 아포(spore)는 사멸되지 않고 일반 영양형 세균만 사멸시킨다.

② 고압증기멸균(Autoclaving)

고압증기멸균은 포화수증기에 의해서 멸균하는 방법으로 주로 배지의 멸균에 이용된다. 기압증기 멸균에는 고압증기솥을 이용하여 121℃, 15 lb에서 15~20분간 멸균한다. 이 방법은 아포(spore)도 사멸 시킬 수 있는 것으로 1회 멸균으로 충분하다.

③ 간헐멸균(intermittent sterilization)

100℃의 증기 속에서 30~60분간 멸균시킨 다음 24시간 방치하였다가 같은 방법으로 3일 연속 실시한다. 배지의 멸균에 적합하나 멸균 종료까지 3일이 소요된다. 특수배지의 멸균(100℃ 이상으로 상승시키면 배지성분이 변하는것, 특히 당분해용 배지 등의 당배지와 담즙배지, 우유가 함유된 배지 등)에 사용된다.

④ 응고멸균(Inspissation)

80~90℃에서 60분간 혈청응고기를 이용하여 실시한다. 단백을 고농도로 함유한 배지(Ogawar 계란배지, Lӧeffler 혈청배지 등)를 멸균할 때 쓰인다.

 

4) 여과멸균(filtration for sterilization)

앞에서 설명한 열을 가하는 멸균법에서 변질될 위험성이 있는 재료(혈청, 당, 요소, 효소 등)의 멸균과 바이러스의 분리, 세균의 대사산물 등을 균체로부터 분리할 때 이용되는 방법이다.

① Seitz filter : 석면을 압축하여 만든다. 유리로 만든 여과판에 비해 pH의 변화, 여액 중의 성분흡착이 적으며, 재생하여 사용할 수 있는 장점이 있다.

② Berkefeld filter : 규조토로 만든다. 여과공의 크기에 따라 V, N, W 3종이 있다.

③ Chamverland filter : 고령토와 규사 혼합물에 고열을 작용하여 만든다.

④ 한외여과법 : cellulose membrane을 사용하는 여과법이다. 여과공의 크기가 매우 다양하여 세균은 물론이고 바이러스를 제거하는 목적에도 사용된다.

 

실험 방법

1.실험 과정

1) Flask에 증류수를 150mL 넣는다.

2) Tryptone 10g/L, NaCl 10g/L, Yeast extract 5g/L. A gar 1.5%를 넣는다.

3) Magnetic bar를 넣고 잘 녹여준다.

4) Autoclave에 15분간 멸균한다.

5) Petri-dish에 적당히(약 20mL정도) 부어준 다음 굳힌다.

실험 결과

1. 결과 분석

멸균된 배지를 얻었다.

토의 사항

1. 실험 고찰

Autoclave 사용 시 압력이 완전히 내려간 후 문을 열어 줘야 한 다. 과열된 배지가 끓어 넘치지 않게 주의한다. 멸균과정에서 수 증기에 공기가 혼합되어있으면 121℃까지 온도가 상승하지 않아 멸균이 일어나지 않을 가능성이 있으므로, 처음 일정 조건까지 올 라갔을 때 내부에 들어있던 공기를 수증기와 함께 배기구를 통하 여 배출해 주어야 한다.