[생명공학실험]세포 배양(Cell Culture) 3부






실험 방법


1. PLGA / PVA Emulsion production

1) 50㎖ 용량의 비커에 PLGA 150㎎을 넣어주고 DCM(Dichloromethane) 30㎖을 추가로 넣어주고 잘 녹여준다. 250㎖ 비커에 증류수 50㎖을 넣고 PVA 1500㎎을 넣어주고 마그네틱바로 교반해서 녹이고, PLGA를 녹인 DCM에 1㎖의 Q.D를 추가해 준다.


2) PVA가 모두 용해되었을 때 PVA를 녹인 비커에 DCM에 녹은 PLGA 용액을 추가시켜주고 균질기(Homogenizer)를 사용해서 24000rpm 으로 1분간 섞어 준다.


3) 이렇게 섞어준 다음 6시간동안 교반시켜 DCM을 증발시킨다. 이후에 회전증발기를 사용해서 37℃의 가열된 물에서 남아있는 DCM을 분리해내고 원심분리기를 사용해서 15000rpm으로 20분동안 Centrifuge down시키고 상등액은 조심스럽게 따라버리고 증류수를 넣고 바닥에 가라앉은 고체를 Vortexing하여 물에 잘 풀어주고 원심분리 시키는 과정을 3회 반복함으로써 세척을 해준다.


4) 세척이 끝난 물질에 증류수를 넣고 Vortexing하여 잘 풀어준 후에 액체질소를 사용해서 동결시켜주고 동결건조기에 연결하여 3일정도 동결건조 하여 시료에 있는 수분을 제거시켜 주고 3일후에 시료를 채취하여 주사전자현미경(SEM)으로 Emulsion의 나노입자 Image를 알아봄으로써 합성이 잘 이루어 졌는지 확인한다.


500㎎의 PLGA를 30㎖의 Ethyl acetate에 녹인다.

150㎎의 PVA를 50㎖의 D.W에 녹인다.

PLGA에 1㎖의 QD를 넣은 후, 1시간 동안 교반시킨다.

두 액체를 섞은 후, 24,000rpm으로 10분간 균질교반시킨다.
Rotary evaporation을 이용하여 Ethyl acetate를 날린다.

12,000rpm으로 15분간 centrifugation한다. (3times)

동결건조 한다.

 

2. Cell Thawing

1) 액화질소에서 냉동상태의 세포를 꺼낸다. 그 후에 36.5℃에 항온수조에 넣고 30초 동안 녹인다.


2) Micro pipette으로 medium 3㎖와 세포를 tube에 넣어준다.


3) 동결보존액 중 동결손상 방지용 DMSO를 제거하기 위해서 1500rpm 으로 5분간 원심분리 해준다. 상층액을 Suction해주고 분리된 세포에 medium 5㎖를 넣고 pipetting해 잘 섞어준다.



4) 25㎖의 T-flask에 medium 5㎖와 세포를 옮겨준 후 incubator에서 배양한다.

 

3. Cell Culture

1) 실험에 들어가기 전에 clean bench주변을 Ethanol을 뿌려준다.


2) 그리고 T-flask의 배지를 Suction하고 5㎖의 PBS를 넣고 3분간 유지한다.(25㎖→5㎖, 75㎖→10㎖)


3) 그 후 PBS를 제거하고 3㎖의 Trypsin-EDTA를 넣고 incubator에서 5분간 유지한다.


4) 떨어져 나온 세포를 15㎖ tube에 옮기고 1000rpm에 3분동안 원심분리 후 상층액을 제거해준다.


5) 25㎤ T-flask를 준비하고 이것에 8㎖의 배지를 넣어준다.


6) 원심분리한 tube에 6㎖의 배지를 넣고 고르게 섞이도록 Pipetting 한 후 3개의 T-flask에 각각 2㎖씩 넣는다.


7) 모두 3개의 T-flask를 Incubator에 보관하고 주변을 정리, 청소한다.

flask의 배지 Suction
PBS 주입 후 3분 대기

Suction 후 Trypsin-EDTA 주입
인큐베이터에 넣어 세포를 떨어뜨린다

세포를 15㎖ 튜브로 옮긴 후 원심분리기 가동
상층액 제거 후 배지 주입, Pipetting

배지를 넣어둔 T-flask에 주입
인큐베이터 보관
 

4. Cell Freezing

1) Cell 동결을 하기에 앞서 실험에 쓰일 시약 PBS, trypsin-EDTA, 동결액을 항온조에 넣어 놓는다.


2) Clean Bench에 있는 UV lamp를 30분간 작동시키고 Clean Bench 주변을 Ethanol로 소독시킨다.


3) 인큐베이터에서 세포가 들어있는 T-flask(75㎤)를 꺼낸 후 T-flask의 배지 용액을 suction한다.


4) 이 때 tip이 바닥에 닿아 세포가 빨려 들어가지 않도록 주의한다.


5) 완충용액으로서 PBS를 10㎖ 넣은 후 3분 간 대기 후 PBS를 suction 한다.


6) Trypsin-EDTA 5㎖를 투입한 후 인큐베이터에 넣고 5분간 대기한다.Trypsin-EDTA에 의해 떨어져 나온 세포를 미리 만들어 놓았던 동결액 5㎖를 투입하며 pipetting을 해준다.


7) T-flask(75㎤)의 용액을 세포와 전부 conical tube에 넣는다.


8) 원심분리기에 1000～1500rpm으로 3분간 원심분리 해준다. 그 결과물 중 상등액을 suction한다. 위와 마찬가지로 바닥에 닿지 않게 한다. conical tube에 남아있는 침전물위에 준비해 놓은 동결액을 6㎖를 넣어주고 고르게 pipetting을 실시한다.


9) pipetting 실시 후 1.5㎖를 추출하여 2개의 eppendorf tube에 옮겨 담는다. 옮겨 담은 Eppendorf tube에 조와 실시 날짜를 표기한 후 Freezer에 24시간 보관해준 뒤 액체질소에 보관한다.


10) 실험이 끝난 후 사용했던 용액은 파라필름을 사용하여 밀폐시킨 후 PBS는 상온보관, trypsin-EDTA와 배지용액을 냉장보관 한다.


11) 사용한 일회용 pipette과 유리 pipette, conical tube, T-flask(75㎤)는 70% Ethanol로 소독을 실시하여 멸균처리 후 모아 처리한다.


12) 마지막으로 Clean bench 또한 Ethanol로 소독 멸균 처리한 후 램프를 UV램프로 전환하고 셔터를 완전히 내려놓음으로 실험을 마무리한다.


T-flask의 배지 Suction
PBS 주입 후 3분 대기

Trypsin-EDTA 주입
인큐베이터에 넣어 세포를 떨어뜨린다

세포를 15㎖ 튜브로 옮긴 후 원심분리기 가동
상층액 제거 후 동결용 배지 주입, Pipetting

1.5㎖ 추출해 eppendorf tube에 보관
Deep freezer에 24시간 동결 후 액체질소 보관

 

5. Cell Counting

1) 암세포가 섞여있는 현탁액을 잘 섞어서, 핵이 침전되지 않도록 주의하여 Micropipette을 사용하여 소량의 액체를 채취해 hemacytometer(혈구계산판)에 떨어뜨리고, 커버글라스를 덮는다.


2) hemacytometer를 수평으로 유지하고 여러 부분의 세포의 수를 세어 평균값을 계산한다.


3) 위의 방법으로 Counting 한 세포수는 0.1㎕당의 세포수이다. 1㎖당 세포농도를 구하고자 하면 Counting 한 세포수에 104 을 곱해준다. 세포핵의 농도가 원하는 농도보다 높으면 현탁액의 농도를 희석하여 사용한다.

 

① hemacytometer에 cover glass를 덮고 cell을 10㎕ 취하여 hemacytometer V모양 홈에 loading한다. (모세관 현상에 의해 고루 퍼지게 된다)

② 현미경으로 관찰하면서 격자 안에 있는 cell의 수를 센다.


6. Nanosphers를 주입한 암세포(A549)이미지 관찰

1) 암세포(A 549)를 세포배양액에 희석시켜서 원하는 농도로 만들어 준 다음 Eight well plate에 적절한 암세포농도(1x105 개 / 1㎖)의 암세포부유배양액 200㎕를 각각의 well에 나누어 준다.


2) 24시간 동안 Incubator에서 보관해 주고 이후에 배지를 Suctiuon해내 주고 PBS로 3회 washing후 3개의 well에 신선한 배지 180㎕ 과 PBS에 용해시킨 PLGA(1㎎/㎖)을 20㎕를 넣어준다.


3) 나머지 well 한 개엔 배지 200㎕만 넣어준다. 30분간 incubation 시켜주고 약물이 섞인 배지를 다시 Suction 해내준다.


4) 다시 PBS 200㎕를 넣고 well을 3회 washing을 반복한다.


5) 4% Formaldehyde(in PBS)를 200㎕ 넣어주고 15분후에 Formaldehyde를 Suction해내주고 PBS 200㎕를 넣어 잘 흔들고 다시 Suction 해 세척해낸다.


6) Eight well plate의 칸막이를 제거해 준 후 mounting solution을 well 마다 한 방울씩 떨어뜨려 주고 테두리에 접착물질을 바른 다음 커버글라스를 덮어 장시간 동안 관찰이 가능한 상태의 표본을 만들어 준다.


7) 그 후 Confocal Laser Scanning Microscope (공초점 레이저 주사 현미경)을 통해서 형광물질이 들어가 있는 암세포와 대조군의 암세포 표본을 관찰한다.






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