[생명공학실험]세포 배양(Cell Culture) 2부






실험 기구 및 시약


1. 실험 기구

(1) 균질기(Homogenizer)

유화기라고도 하며 기계적으로 조직이나 세포를 파괴하여 마쇄물을 만들거나 유화하는 장치나 기구의 총칭이며, 시료의 충분한 혼합, 교반, 분쇄에 사용되며, 스테인리스 스틸 등으로 만들어져 있어 작은 틈새로 압력을 가해서 공기를 빠르게 통과시켜서 외벽에 충돌시켜서 섞이지 않고 나눠져 있는 두 물질을 잘 혼합시켜 주는 역할을 한다.


그림 1. 균질기

 

(2) 회전증발기(Rotary Evaporator)

회전증발기란 용매를 회전시키면서 용매를 날리는 장치를 말한다. 회전증발기는 진공을 걸어주는 부분과 그리고 용매를 날리는 부분과 그리고 냉각하는 부분 이렇게 크게 세부분으로 나눌 수 있다. 진공을 걸어줌 으로서 낮은 온도에서도 용매를 날릴 수 있으며(압력과 온도와의 관계를 고려한 후) 진공상태의 플라스크 안의 용매는 이미 사용자가 정해준 온도, 회전속도, 시간에 의해서 날아가기 시작한다. 이 날아가는 용매는 응축기에 의해서 다시 액상으로 변하여 받아주는 플라스크 안으로 떨어진다. 충분히 용매를 날린 후 원하는 생산물을 얻는다.


그림 2. 회전증발기

 

(3) Vortex

잘 섞이지 않는 액체를 섞을 때, 고체를 액체에 분산시킬 때나 섞어줄 때 사용하는 기기로 진동을 일으켜서 용기 내에 액체를 빠르게 회전시켜 섞어준다.


그림 3. Vortex

 

(4) 동결건조기(Freeze Dry)

원료를 빙점 이하의 온도로 급속 동결시켜 일정한 진공 조건하에서 승화에 의해 수분을 제거하는 원리이다. 저온, 진공, 동결 상태에서 재료내의 수분이 제거되므로 재료성상의 물리적, 화학적 변화가 극도로 작고, 가수에 의한 복원성이 좋은 고부가 건조제품을 획득할 수 있다.


그림 4. 동결건조기

 

(5) 형광 현미경(Fluorescent microscope)

레이저를 광원으로 하여 point source에서 나오는 광을 사용해서 시료의 초점과 detector pinhole의 상의 초점을 일치시켜(confocal) 초점면 이외의 부분은 현미경 상에 나타나지 않게 함으로써 기존의 형광현미경 보다 초점면에 대한 해상도가 1.4배 정도 높다. 시료의 형태와 내부구조의 시각화가 가능하며 시료의 3차 원 구조 및 미세 형태 해석에 유용하며, 세포 또는 조직의 미세구조 관찰에 적합하다. 세포의 활성에 따 라 변화하는 세포내 Ca2+, Mg2+ 거동 및 세포 조직의 3차원 입체 구조 관찰에 이용 된다.


그림 5. 형광 현미경(Fluorescent microscope)

 

(6) 혈구계산기(Hemacytometer)

용액 내에 존재하는 세포의 수를 세어 농도를 구할 수 있다. 위의 방법으로 Counting한 세포의 수는 0.1㎕당의 세포수이다. 1㎖당 세포농도를 구하고자 하면 Counting 한 세포의 수에 104 을 곱해준다.

 

그림 6. 혈구계산기(Hemacytometer)

 

(7) 무균실험대(Clean Bench)

물리적으로 격리한 상자형의 구조 내에 공기의 수직층류를 형성하여 극력미진입자를 여과 할 수 있는 필터로 미립자나 균을 제거한 깨끗한 환경에서 미립자나 미생물, 유전자 DNA 등이 밖으로 흩어지지 않게 조작할 수 있도록 고안한 기기를 말하며 적층회로를 만드는 방등 미립분진의 혼입이나 산란이 차단되는 장소나 병원의 수술실 및 유전자조작을 실시하는 장소에서는 필수적인 설비이다.



그림 7. 무균실험대(Clean Bench)


(8) 세포 인큐베이터(Cell Incubator)

생물이나 그 일부(세포 등)를 일정한 온도 하에서 사육 또는 배양하기 위한 상자형 기구로 배양장치의 일종. 알을 부화시키기 위해 내부온도가 일정하게 유지된다. 미생물학 분야에서는 주로 세균의 배양에 사용해 왔다. 단열이 좋은 상자의 내부에 온도 제어기를 설치한 것이 기본구조이다. 인큐베이터라는 용어의 의미 확대(부란하다, 일정온도로 유지하다)로 항온 조절장치까지 인큐베이터라고 부르게 되었다. 동물세포의 배양용으로 이산화탄소 농도를 일정하게 유지하도록 설계되어 있어 CO2 항온기(CO2 인큐베이터)라고 부르기도 한다.


그림 8. 세포인큐베이터(Cell incubator)

 

(9) 원심분리기(Centrifuge)

고체-액체상의 분리의 첫 단계로써 생물분리공정에 원심분리를 사용한다. 이 고체는 중력의 영향으로 서서히 가라앉게 하는 침전의 과정을 밟게 되는데, 서서히 침전되는 것을 원심력을 이용하여 가속하는 과정을 원심분리라고 한다. 원심분리기의 구동방식에 따라 일반적으로 이용되는 전기모터 구동방식, 초원심분리를 할 경우 고속으로 오랜시간 동안 모터를 돌릴 수 있게 동력을 터빈으로 하는 터빈 구동방식이 있다.


그림 9. 원심분리기(Centrifuge)

 

(10) T형 배양병(T-flask)

세포배양시 사용하는 조직배양병. 상하면이 넓고 두께를 얇게하여 세포의 부착배양시 용이하고 병의 입구와 밑바닥의 끝을 삼각형으로 하여 피펫조작시 편리하다.


그림 10. T-flask


(11) Micro pipet

1～1000㎕ 의 용량과 같은 적은양의 액체를 옮길 때 사용한다. 일정량의 액체를 빨아들인 후 유지할 수 있도록 만들어졌다.


그림 11. Mircro pipet


(12) Aspirator(흡입기)

물이나 공기를 흡입할 수 있는 펌프를 말한다. 석션(suction)기 라고도 하며 세포실험에서는 배지나 PBS, Trypsin-EDTA 등을 T-flask에서 Suction해낼 때 사용한다.


그림 12. Aspirator(흡입기)

 

2. 실험 시약

(1) A549 cell


(2) PBS(phosphate buffered saline)

PBS는 phosphate buffered saline의 약자로 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이는 완충용액(buffer)이다. 완충용액이란 수소이온과 결합하거나 수소이온을 방출하는 능력을 가진 물질로서, 산 또는 염기의 양이 상당히 많아져도 용액의 pH를 비교적 일정하게 유지한다. 완충용액은 실험에 따라 사용하는 용도, pH범위, 온도, 등이 다르기 때문에 선택하여 사용해야만 한다. 일반적인 버퍼 선택기준은 다음과 같다.


① pKa의 값이 6-8사이 정도

② 용액 내에서의 높은 용해성

③ 생체막의 투과성

④ 염에 의한 영향이 적을 것

⑤ 농도, 온도, 이온들에 의한 영향이 적을 것

⑥ 양이온과의 특별한 반응에 대해 알려진것이 없거나 전혀 없는 것

⑦ 화학적인 안정성

⑧ 240㎚-700㎚의 빛에 대해 흡광이 되지 않을것

⑨ 순도가 높게 얻을 수 있는 것


PBS는 실험에서 다음과 같은 역할을 가진다. 첫째, 이온세기를 맞추어 주는 역할을 한다. 우리 몸은 일정 농도의 이온농도를 가지고 있어서 이온농도가 너무 높거나 낮을 경우에는 삼투작용에 의해 세포가 수축하 거나(외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여(외부이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴 될 수 있다. PBS는 체액 농도와 등장액으로 세포가 파괴되는 것을 막아준다. 병원에서 사용되는 생리식염수라고 하는 것도 이온농도를 체내와 동일하게 맞춘 0.9%의 NaCl 수용액이다. 둘째, 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해 준다. 급격한 pH변화는 여러가지 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질(효소)의 기능이 이러한 pH변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있다.


그림13. 안산완충식염수 (PBS)

 

(3) FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청)

소태아혈청으로 세포배양에 많이 사용된다. 아미노산, 비타민, 당 및 기본적인 염류를 포함하는 합성배지를 보충하는 혈청성분이 함유되어 있다. FBS을 넣어주면 그 안에 들어있는 trypsin inhibitor(트립신 저해제)가 트립신의 활성을 억제해서 세포가 더 이상의 손상을 입지 않도록 해주는 역할도 한다.


그림 14. FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청)

 

(4) Trypsin-EDTA

Trypsin은 단백질 분해효소이다. 세포가 다른 세포 또는 배양접시 바닥에 붙어있는 것은 세포막에 있는 adherent protein에 배양접시 바닥에 코팅되어 있는 물질과 결합에 있는 것인데 트립신이 이 단백질을 분해해서 바닥으로부터 떨어져 나오고 다른 세포와도 분리되게 되는 것이다. 이 단백질들이 다른 세포 또는 바닥에 붙기 위해서는 Ca2+와 같은 2가 양이온이 필요한데 EDTA는 chelator로써 2가 양이온을 킬레이팅시켜 위 단백질들이 이 양이온을 이용하지 못하도록 해주는 것이다. 따라서 결합력이 낮아지게 된다.


트립신은 세포막에 노출되어 있는 모든 단백질을 비선택적으로 분해하기 때문에 장시간 트립신에 노출되어 있으면 세포가 타격을 입고 결국 죽게됩니다. 이 때 FBS(fetal bovine serum)을 넣으주면 그 안에 들어있는 trypsin inhibitor(트립신 저해제)가 트립신의 활성을 억제해서 세포가 더 이상의 손상을 입지 않도록 해주는 것이다. EDTA는 독성이 크지 않고 희석되어 영향이 없다.


그림 15. Trypsin-EDTA

 

(5) 살균용 ehthanol의 농도

무균조작시 사용하는 ethanol의 농도는 70%가 일반적이다. 분무기에 미리 준비하여 사용하는 것이 좋으며 70% ethanol을 뿌려 살균한 후에 남아있는 잔여물은 autoclaving등으로 미리 무균화된 거즈로 닦아낸다.

 

(6) DMSO(dimethyl s㎕foxide)

DMSO는 극성이 강하여 물과 잘 혼합됨으로 물을 반응용매로 하는 유기반응에서 물과 혼합되어 사용하고, 여러 가지 생물실험을 할 때 유기물질을 녹이는 용해 보조제 역할을 하며, 세포를 냉동 보관할 때 사용되는 freezing solution의 성분이다. 세포 내, 외부에 얼음 결정이 생기는 것을 방해하여 얼음결정으로부터 오는 세포 구조 손상이나 삼투압 스트레스 등으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.

 

(7) RPMI 1640

혈구 세포를 in vitro에서 장기간배양하기 위한것으로 Moore et al에 의해 Rosewell Park Memorial Institue 에서 개발하여 RPMI 라 명명했다. 아미노 에이시드와 바이타민을 적절하게 혼합하여 정상 또는 신생종양성 leukocyte등의 현탁성 세포를 배양하는데 널리 사용되며, 여기에 들어가는아미노산과 비타민 그리고 각각의 시약들은 약40여가지 종류가 있다.


그림 16. RPMI

 

(8) Penicillin

세포를 배양하는 데 있어서 가장 중요한 것은 무균적인 작업이다. 페니실린이나 타 세균 억제제를 사용하지 않으면, 세포가 오염되어 세포의 증식속도를 저하키시고 동시에 세포기능에 심각한 변화를 초래할 수 있다.

 

(9) PLGA

PLA(Poly Lactic Acid)와 PGA(Poly Glycolic Acid)의 공중합체로 PLGA-poly(lactic-co-glycolic acid)는 생분해성과 독소안정성, 생체적합성이 뛰어나기 때문에 의약계열에서 널리 이용되는 소수성 고분자다. 합성 고분자로써는 드문 경우지만 치료용으로 인체에 사용할 수 있도록 승인 되었고, PLGA를 사용하면 약물 전달 체계에서 약물방출시기를 조절하여 한번의 투약으로 짧게는 며칠 길게는 몇 달까지 약물의 효과를 지속시킬 수 있는 서방출 약물의 제조가 가능하다.


그림 17. PLGA의 구조식

 

(10) PVA(Poly(vinyl alcohol))

PVA(Poly Vinyl alcohol)는 물에 녹는 친수성물질로 PLGA의 겉을 코팅해 주는 역할을 해주며 동시에 유화제, 에멀션화제의 역할을 해주기 때문에 Oil in water Emulsion의 제조에 도움을 준다.


그림 18. PVA의 구조식

 

(11) Q.D(Quantum dot), 양자점

Q.D(Quantum dot, 양자점)란 약 2∼10㎚(나노미터) 크기의 중심체와 ZnS(황화아연)으로 이뤄진 껍질로 구성되며, 껍질 밖 표면에 고분자 코팅을 하기 때문에 통상 10∼15㎚ 크기의 나노입자를 가지게 된다. 양자점의 중심체로는 CdSe, CdTe, CdS가 주로 사용된다. Q.D는 좁은 파장대에서 강한 형광을 발생시킬 수 있으며, 입자가 작을수록 짧은 파장의 빛이 발생하고, 입자가 클수록 긴 파장의 빛을 발생하는 매우 특수한 성질이 있어 양자점의 크기를 조절하면 원하는 파장의 가시광선 영역의 빛을 모두 낼 수 있다. 그러나 Q.D는 구성하고 있는 물질은 인체에 사용하기 부적합한 중금속이 포함되어 생체에서 독성을 나타낼 수 있다.


그림 19. 양자점의 구조와 사진





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