[생명공학실험]세포 배양(Cell Culture) 1부









실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

실험에 사용되는 암세포(A549)의 medium제조 와 Cell-thawing, Cell-Culture의 실험방법에 대해서 알아보았다. 암세포를 배양할 때는 몸 안에 있을 때와 비슷하게 적절한 환경을 만들어 주어야한다. 암세포가 몸 안에서는 면역에 의해 균이 없는 상태에서 죽지 않고 자라지만 체외로 노출된 상태이므로 균에 의한 오염이 되기 쉽다. medium제조와 Cell-Culture시 깨끗하게 clean bench와 주변, 실험복 등을 70% ethanol로 소독하고 멸균된 상태에서 진행해야 한다. 배지가 암세포가 배지의 영양성분을 섭취하기 때문에 일정기간마다 배지를 교체해 주고 SubCulture 주어야 한다.


PLA(Poly Lactic Acid)와 PGA(Poly Glycolic Acid)의 공중합체로 PLGA-poly(lactic-co-glycolic acid)는 생분해성과 독소안정성, 생체적합성이 뛰어나기 때문에 의약계열에서 널리 이용되는 물질이다. 합성고분자로써는 드문 경우지만 치료용으로 인체에 사용할 수 있도록 승인 되었고, PLGA를 사용하면 약물 전달 체계에서 약물방출시기를 조절하여 한 번의 투약으로 짧게는 며칠 길게는 몇 달까지 약물의 효과를 지속시킬 수 있는 약물의 제조가 가능할 것으로 기대되며, PLGA내에 약물을 봉입하여 합성을 하기 이전에 연습단계로 PLGA를 PVA로 Oli in water Emulsion을 만든다. PVA(Poly Vinyl alcohol)는 물에 녹는 물질로 PLGA의 겉을 감싸 주는 역할을 해주며 동시에 유화제, 에멀션화제의 역할을 해주기 때문에 O/W Emulsion의 제조에 도움을 준다. 또한 대부분의 약물은 소수성의 성질을 갖는데 인체 내에서 소수성약물의 효율이 낮아 질 수 있기 때문에 이러한 현상을 방지하기 위해 친수성 물질인 PVA로 코팅 해준다.


본 실험에서 우리의 최종목적은 250㎚ 크기의 균일한 나노입자를 만드는 것이다. 나노입자의 크기가 모두 똑같을 수는 없겠지만 가능하면 250㎚에서 입자크기 오차범위를 줄여야 하고 또한 표준크기인 입자가 적절한 수준으로 많이 나타나야 바람직한 합성이 이루어졌다고 할 수 있다. Q.D(Quantum dot, 양자점)를 PLGA 내에 봉입시켜 암세포에 투여하고 이후에 모습을 관찰하기 위해서 Q.D가 봉입된 PLGA를 제조한다.


Q.D(Quantum dot, 양자점)란 약 2∼10㎚(나노미터) 크기의 중심체와 ZnS(황화아연)으로 이뤄진 껍질로 구성되며, 껍질 밖 표면에 고분자 코팅을 하기 때문에 통상 10∼15㎚ 크기의 나노입자를 가지게 된다. 양자점의 중심체로는 CdSe, CdTe, CdS가 주로 사용된다. Q.D는 좁은 파장대에서 강한 형광을 발생시킬 수 있으며, 입자가 작을수록 짧은 파장의 빛이 발생하고, 입자가 클수록 긴 파장의 빛을 발생하는 매우 특수한 성질이 있어 양자점의 크기를 조절하면 원하는 파장의 가시광선 영역의 빛을 모두 낼 수 있다. 그러나 Q.D는 구성하고 있는 물질은 인체에 사용하기 부적합한 중금속이 포함되어 생체에서 독성을 나타낼 수 있다. 그러한 이유로 생체적합성 고분자인 PLGA내에 Q.D를 봉입하여 비교적 안정성을 높이는 것을 목적으로 한다. 이렇게 PLGA 내에 봉입된 Q.D PBS에 용해시키고 우리가 직접 키운 암세포(A 549)에 Q.D가 봉입된 PLGA를 투여해보고 PBS만을 넣은 대조군 암세포와 비교해 본다.

 

2. 실험 배경

21세기 난치병인 암 치료를 위해 외과수술, 약물치료(화학요법), 방사선치료, 면역요법 등 새로운 기술들이 비약적으로 발전하고 있음에도 불행히 암에 의한 사망률은 크게 줄어들지 않고 있다. 암 치료를 위한 화학요법은 통상 암환자를 대상으로 널리 시술되고 있지만, 낮은 치료율 및 약물부작용 등으로 인하여 심각한 한계를 보이고 있다. 흔히 화학요법에 사용되는 항암제는 암조직에 대한 선택성이 부재되어 있어 암조직 및 정상 조직을 구분하지 못하고 정상조직을 공격, 심각한 손상을 가하게 된다. 화학요법을 시술받는 암환자의 대다수가 극심한 부작용으로 인하여 화학요법을 중단할 수밖에 없는 것이다. 특히, 화학요법 중 항암제의 반복적 투여는 궁극적으로 암 치료 효과보다는 암세포가 항암제에 꾸준히 길들어져 항암제에 대한 강한 내성, 즉 다중약물내성(m㎕tidrug resistance)을 일으키는 원인이 되기도 한다.



암세포로 유입되려는 항암제를 세포 밖으로 토해내거나 생리 대사를 일으켜 항암제의 효력을 괴멸시키는 다중약물 내성은 결국 항암 치료 자체를 무력화시키는 것이다. 암세포의 다중약물내성 인자 중, P-glycoprotein(Pgp), m㎕tidrug resistance protein(MRP), breast cancer resistance protein(BCRP)는 항암제의 세포내 침입을 차단하는 기능을 가지고 있으며, lung resistance protein(LRP)는 세포내로 흡수된 항암제를 다시 세포내 소기관내로 재배치하고 궁극적으로 항암제를 방출하는 기능을 가지고 있다. 또한 heat shock protein(HSP)과 bcl-2는 설령 항암제가 세포 안으로 들어와 세포사멸기작을 일으킨다해도, 암세포 자체적으로 생존 유지 기능을 발휘하는데 일조한다.


그 외에도, 암세포와 암세포간의 상호 정보교환 및 암세포와 주변 stromal 세포간의 정보교환을 통해, 항암제의 침입시 암세포 자체의 생존 유지 기능을 강화하는 유전적 변화를 보이기도 한다. 이러한 형태들은 궁극적으로 항암제 자체의 효능을 약화시켜 항암요법을 시도하더라도 암세포의 성장 및 전이를 억제하지 못하게 되는 원인이 되는 것이다. 또한 최근에 암세포 생물학에 있어서 주목되고 있는 암 줄기세포는 현재의 시판 의약품으로는 도저히 치료를 할 수 없는 중요한 현안 중의 하나이다.


실험연구 목적의 암줄기세포의 배양 및 분석과 같은 기초 연구조차 아직 정립이 되지 않은 상황에서, 암줄기세포를 치료하는 것은 아직 요원한 일일 수밖에 없다. 암 줄기세포는 기존의 줄기세포가 일종의 돌연변이를 일으켰거나 혹은 환경적/유전적 요인에 의해서 발생한 것으로, 암세포의 다중약물내성현상과 유사하면서도 훨씬 강력한 자기 보호 기작을 가지고 있어 기존의 항암제의 영향을 전혀 받지 않는다. 이러한 암줄기세포는 체내 암조직이 수술 혹은 항암요법 등에 의해 거의 사멸이 되었더라도 향후 암의 재발에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 새로운 유전자치료방법 및 신약 개발 등이 암줄기세포를 치료하기 위해 제안되고 있으나, 그 효용성은 아직 명확하지 않다.


위의 사례와 같이 암치료에 있어서, 특히 항암제를 활용한 그 방법에 있어서 암세포와 정상세포를 구분하는 항암제의 암인지 능력뿐만이 아니라, 다중약물내성을 극복할 수 있는 능력, 더 나아가 암줄기세포까지 제거할 수 있는 능력까지 포함될 때야 비로소 강력한 항암 효능을 기대할 수 있는 것이다.


이 같은 복잡한 기능성을 항암 약물 자체에 한꺼번에 부여하는 것은 쉽지도 않고 화학적 수식화 과정 중에 오히려 약물 자체의 항암 효능을 감소시킬 수 있다. 이에 반해 항암 약물의 화학적 수식화없이 기능성 고분자 소재만을 활용한 항암 약물전달시스템으로의 접목은 상대적으로 짧은 시간과 적은 투자비용으로 성공적인 항암 효능 증진 효과를 거둘 수가 있다.


세포배양은 원핵세포, 진핵세포, 식물세포 등의 생체조직을 특정조건의 in vitro 상태에서 일정시간 생육시키는 과정으로 세포나 조직을 독립된 생명체로 인식함으로서 생명현상의 이해, 연구에 이용된다. 세포배양에 이용되는 세포로는 개체로부터 탈락된 정상적인 구조와 기능을 가진 정상세포와 특정조건 하에서 배양되어 정상세포로 무한증식을 할 수 있는 세포수립주라고도 불리는 불멸화세포, 그리고 발암물질이나 방사선등을 가하여 암세포와 같이 변화한 형질전환세포가 있는데, 정상세포는 약 50회 정도로 세포분열이 제한되어 있기 때문에 특정조건을 충족시켜 증식 가능한 상태로 유지시키는 불멸화세포가 정상세포의 연구에 대신 이용되기도 한다.


세포는 37℃, 5% CO2와 같은 온도와 혼합기체 조건의 세포배양기에서 증식하고 그 중식상태가 유지되는데, 세포의 종류에 따라 배양 조건이 매우 다양하고 다양한 배양조건은 각각의 세포들이 다른 표현형의 세포로 발현되는데 기여한다. 온도와 혼합기체 이외에도 pH, 삼투압, 점성, glucose의 농도, growth factor, 영양물질 등의 다양한 요인들이 작용을 한다. 동물세포의 정상적인 pH는 7.4～7.7 정도로, 세포는 증식을 하면서 많은 노폐물들을 방출 하는데, 이 물질들이 배지를 산성상태로 만들기 때문에 phenol red와 같은 지시약을 첨가하여 배지의 색을 관찰할 수 있다. 예를 들면 phenol red는 중성에서는 적색을 띄지만 대사가 왕성한 세포나 암세포대사는 물질대사과정에서 정상세포보다 빠르게 latic acid가 생성되어 산성화 되므로 배지가 빠르게 황색으로 변한다. 반면 CO2의 공급이 부족할 경우 정상세포보다 염기성 상태가 되어 자색을 띄게 된다. 이처럼 배지에 포함된 지시약의 색 변화를 관찰함으로서 세포의 생육조건을 추측할 수 있고 배지교환 등의 필요한 조치를 취할 수 있다.


정상세포는 G1 → S → G2 → M 기를 거치며 복제와 분열을 거듭한다 세포주기단계를 신호하는것은 사이클린 의존성 키나아제(Cdk) 라 불리는 단백질 종류의 할성화에 기인한다. 그러나 암세포에서는 사이클린-Cdk의 조절이 손상되어있다. 예를 들면 매우 빨리 생장하는 유방암 세포는 사이클린 D를 매우 많이 갖고 있고, 이것이 Cdk4를 과대 자극시켜 결과적으로 세포분열이 많아지게 한다. 정상세포에서 분열을 억압하는 주된 단백질은 p53이다. 이 p53은 p21을 합성하게 하고 그로 인해 Cdk를 억압한다. 사람 암 중의 절반 이상은 손상된 p53을 갖고 있고, 그 결과 세포주기 조절이 없게된다. 그러나 계속증식하는 암세포의 특성을 이용하여 단일클론항체를 만들어 이용할 수 있다.






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