[일반생물학실험]DNA 전기영동의 원리와 방법

실험 이론 및 원리

1. 실험 배경

본 실험은 DNA 전기영동의 원리를 이해하고 전기영동에 방법에 관해 알아보는 실험이다. 단백질과 DNA, RNA 등은 전하를 띠는 성질을 가진다. 전하를 띤다는 성질을 통해 DNA, RNA 또는 단백질을 전기장 사이에서 이동시켜서 크기, 전하 또는 구조가 다른 조각을 분리시키는 것을 전기영동이라고 한다. 즉 DNA전기영동을 통해 단백질 DNA분자의 크기나 순도를 분석할 수 있는 것이다. DNA는 구조상 인산기를 가지고 있어서 전기영동에 사용되는 버퍼 안에서 음전하를 띠고 있고 양전하와 음전하의 전극 사이에 위치했을 때 (+)극으로 움직인다는 기본적인 원리를 가진다.

이때 agarose나 polyacrylamide와 같은 겔의 사이를 DNA분자가 통과하는 속도는 분자량이 커질수록 그리고 겔의 농도가 높을수록 늦어지게 된다. 아가로스 겔이란 DNA단편을 200bp에서 50kb까지 분리가 가능하고 사용이 편리하여 현재 주로 사용되고 있는 전기영동법이다. 아가로스 겔은 선형 중합체의 형태를 하고 있는데 TAE buffer 인 완충용액에 아가로스 겔을 녹여서 겔이 굳은 후에 사용한다. 겔이 굳을 때 아가로스는 지지체 형태가 된다. 이러한 겔에 전기장을 걸면 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동하게 되고 DNA가 이동하는 정도는 여러 요인의 영향을 받게 되는 것이다.

아가로스 겔 전기영동을 할 때에 DNA 이동에 영향을 주는 요인들을 살펴보면 먼저 DNA분자의 크기가 크면 클수록 느리게 이동한다는 성질을 가진다. 그리고 아가로스의 농도가 높을수록 느리게 이동한다는 성질을 지닌다. 그 다음으로 DNA구조에 따라 이동속도가 다른데 일반적으로 슈퍼코일 DNA가 가장 빨리 이동하고 그 다음으로 선형 DNA가 이동하고 다음으로 고리열림 DNA의 순서로 이동을 하게 된다. 또한 아가로스 겔 전기영동에 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다는 특성을 갖는다.

전기영동에 필요한 TAE 버퍼는 tris, acetate, EDTA의 세 가지 성분으로 구성되어 있는데 tris는 양이온을 공급하여 (-)전하를 띠고 있는 DNA를 끌어주는 역할을 한다. 그리고 EDTA는 DNase의 활성을 억제하며 전기영동을 하는 도중 DNA분해를 방지하게 되는 역할을 한다. 또한 전기 영동에 필요한 DNA의 (-) 전하를 유지시키는 역할도 한다. TAE buffer와는 다르지만 전기영동에 필요한 TBE buffer 같은 경우 tris, borate, EDTA 세 가지 성분으로 이루어져 있고 TBE buffer가 TAE buffer보다 겔에서의 용해도가 더 좋다. 

따라서 TAE버퍼는 DNA분자량이 클 때 주로 사용되고 TBE버퍼는 DNA분자량이 작은 경우에 쓰이게 된다. 이 실험같은 경우는 TBE buffer를 사용한다. 다음으로 이 실험에 사용되는 EtBr은 실험에 사용되는 대표적인 염색 물질으로 얇은 판 모양의 고리화합물이다. 이는 DNA나선 염기 사이에 들어가 결합하게 된다. DNA의 이동속도를 약 10%정도 감소시키는 EtBr은 UV에 노출이 되면 결합한 DNA를 통해 가시광선으로 바꾸어 발광된 밴드를 확인할 수 있게 되는 것이다. 따라서 이러한 원리들을 이용해 DNA전기영동을 할수 있는 것이다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

아가로스 파우더, TBE buffer, 전자레인지, 틀과 콤, BPB dye, DNA, EtBr

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) TBE buffer total vol의 1%에 해당하는 양의 아가로스 파우더를 준비한다. (큰 틀 : TBE buffer 30㎖ powder 0.3g 작은 틀 : TBE buffer 20㎖ powder 0.2g)

2) 플라스크에 파우더를 넣고 파우더 볼륨에 해당하는 TBE buffer를 넣은 뒤 전자레인지를 사용하여 녹인다. 후에 EtBr를 넣고 잘 섞는다.

3) Gel 틀에 조심스럽게 붓는다.

4) 30분 정도 Gel을 굳힌 다음 DNA 시료와 BPB dye가 섞인 혼합물을 Gel Well에 넣어준다.

5) 전기영동 하여 DNA 절편의 크기를 확인한다.

실험 결과

1. 결과 분석

1) TAE buffer의 역할

TAE buffer는 Tris, Acetate, EDTA로 구성되어 있고 Tris는 양이온을 공급하여 음전하를 띠고 있는 DNA를 끌어준다. Tris는 pH가 높기 때문에 DNA의 해리를 방지하려고 pH를 낮추기 위해 acetate가 들어가는 역할을 한다. EDTA는 DNase의 활성을 억제하고 전기영동을 하는 도중 DNA분해를 방지하는 역할을 하며 동시에 전기영동에 필요한 DNA의 음전하를 유지한다. 이와 같은 역할을 지닌 TAE buffer는 DNA분자량이 클 때 주로 사용된다.

 

2) 분자량이 같은 슈퍼코일 DNA와 실선 DNA의 전기장에서의 이동속도는 같은가 다른가? 만약 다르다면 왜 다른가?

슈퍼코일 DNA와 실선 DNA의 전기장에서의 이동속도는 다르다. 이는 아가로스 겔 전기영동에서 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들을 생각해보면 된다. 요인들 중 DNA형태에 따라 이동속도가 다르다는 것을 생각해보면 일반적으로 슈퍼코일 DNA가 가장 빨리 이동한다. 그 다음으로 실선 DNA의 순서로 빠르게 이동을 한다. 따라서 이동속도가 다른 이유는 DNA의 형태가 다르기 때문이다.

 

3) EtBr은 어떻게 DNA와 결합하여 UV하에서 형광을 발생시키는가?

EtBr은 얇은 판 모양이며 고리화합물로 DNA 나선의 염기 사이에 들어가서 결합을 한다. 이 때 UV에 노출되면 EtBr과 결합한 DNA를 통해 가시광선으로 변화시켜 형광색으로 발광된 밴드를 확인할 수 있다. 발광된 밴드는 UV의 파장이 DNA를 통해 흡수되면 그 에너지가 EtBr에 전달되어 형광을 발생시킨다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험에서는 DNA시료를 이용해 DNA전기영동의 원리와 방법을 이해하게 되었다. 많은 방법을 통해 실험할 수 있는 전기영동법의 종류들 중에서 이 실험에 사용된 전기영동은 아가로스 겔을 이용한 전기영동법을 사용하였다. 이 방법은 실험을 하기에 편리하고 실험에 소요되는 시간이 짧으며 원심분리법과 밀도로는 분리가 불가능한 DNA조각들의 혼합물을 분리할 수 있다라는 장점이 있다. 또한 겔에서 EtBr과 같은 시약을 처리해 염색을 하게 되면 자외선에서 DNA를 직접 관찰 할 수 있다. 

특히 EtBr을 사용할 때에는 조심해야 한다. 왜냐하면 이 시약은 강력한 발암물질이자 돌연변이원으로 알려져 있다. 따라서 이 염색약을 다룰 때에는 비닐장갑을 사용했어야 하고 사용 후에 폐기를 해야한다는 유의사항이 존재한다. 이렇게 아가로스 겔을 통한 DNA의 이동속도는 많은 요인들의 영향을 받는다는 것을 알게 되었다. 

DNA의 분자의 크기, 아가로스의 농도, 전류의 세기, DNA의 형태, 염기 조성, 온도 등에 의해 좌우된다는 사실을 알게 되었다. 또한 TAE buffer 와 TBE buffer가 DNA분자량의 크기에 따라 사용이 다르며 각 buffer의 차이점에 대해 알게되었다. 만약 전기영동 실험에서 버퍼용액 대신에 챔버용액이나 또는 겔 용액에 증류수로 대체를 한다면 전기영동이 이루어지지 않을 것이라고 짐작할 수 있다. 왜냐하면 증류수에는 이온이 존재하지 않기 때문이다. 

본이 실험을 실제로 진행한다면 DNA크기가 다른 실험조원들이랑 위치를 비교해보고 동일한 위치에 있다는 것을 통해 목표했던 특정 DNA를 추출할 수 있을 것같다. 따라서 이번 실험을 통해 분자는 음극 전하를 가지고 있어서 양극 전극을 통해 이동한다는 기본원리를 습득하였고 이를 통해 전기영동이 어떤 원리로 이루어지는지, 전기영동에 필요한 실험 기기들의 원리도 습득하였다. 그리고 전기영동이 생체 고분자들의 성질을 연구하며 생체 고분자의 성질을 분석하고 분리하고 정제하는 중요한 방법이라는 것 또한 알게되었다.

 

참고 문헌

1. DNA전기영동의 원리와 방법, K-MOOC