[생명공학기초실험]PCR Buffer 만들기

실험 목적

Tris-HCl, KCl, MgCl2를 이용하여 10배 희석된 10X PCR Buffer를 만들어본다.

실험 이론 및 원리

1. Buffer(완충용액)

외부에서 산이나 염기를 가해주어도 pH의 변화가 거의 없는 용액을 말한다. 다시 말하여 pH를 정하게 맞추어 주는 용액으로 보통 약산과 그 짝염기 혹은 약염기와 그 짝산으로 이루어진 용액. 대표적으로 아세트산 CH3COOH와 그 짝염기 CH3COONa를 들수 있으며 일반적으로 약한 산(weak acid)과 그 짝염기(conjugate base)나 약한 염기(weak base) 와 그 짝산(conjugate acid)을 적당히 혼합함으로써 여러 가지 pH값의 완충 용액을 만들 수 있다.

즉, 완충용액은 약산과 그 짝염기, 또는 약염기와 짝산의 혼합물로 이루어진 수용액이다. 소량의 강산이나 염기가 첨가되면 pH는 거의 변하지 않는다. 완충용액은 다양한 화학작용에서 pH를 거의 일정한 값으로 유지하는 수단으로 사용된다. 완충 용액은 pH를 일정하게 유지시키려는 성질 때문에 용액에서 이온의 용해도를 조절할 때나 생화학적, 생리적 과정 등에서 pH를 일정하게 유지할 때 매우 중요한 역할을 한다.

 

대부분의 생명과정에서 pH가 조금이라도 유지하는 것은 매우 중요하다. 사람의 혈액은 탄산, 인산과 단백질의 조합으로 pH농도가 7.35~7.45 사이를 일정하게 유지한다. 이때 혈액의 pH 농도가 7.0 이하거나 7.8 이상일 경우 사람은 즉시 사망하게 된다. 따라서 혈액은 탄산수소 이온(HCO3-), 인산수소 이온(HPO42-) 단백질 등에 의해 완충 작용이 일어난다.

 

2. Buffer의 선택기준 & PCR에서 Buffer가 중요한 이유

1) pKa의 값이 6~8사이 정도

2) 용액 내에서의 높은 용해성

3) 생체막의 투과성

4) 염에 의한 영향이 적을 것

5) 농도, 온도, 이온들에 의한 영향이 적을 것

6) 양이온과의 특별한 반응에 대해 알려진 것이 없거나 전혀 없는 것

7) 화학적인 안정성

8) 240㎚-700㎚의 빛에 대해 흡광이 되지 않을 것

9) 순도가 높게 얻을 수 있는 것

 

3. PCR에서 Buffer가 중요한 이유

1) 이온세기를 맞추어 주는 역할을 한다.

우리 몸은 일정농도의 이온농도를 가지고 있다. 이온농도가 너무 높거나 낮을 경우에는 우리 몸의 세포가 삼투막으로 되어있기 때문에 지나친 물의 흐름이 생겨 세포가 수축하거나(외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여(외부이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴될 위험이 있다. 우리가 흔히 생리식염수라고 하는 것은 0.9%의 소금을 녹인 수용액으로 위와 같은 이온농도를 유지하기 위한 것이다.

 

2) 단순한 식염수 이외에 완충용액으로의 작용

즉 인산완충용액의 기능을 더한 것으로 이러한 완충용액은 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해준다. 급격한 pH변화는 여러 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질(효소)의 기능이 이러한 pH변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있다. 따라서 이름도 PBS, Phosphate Buffered Saline, 인산완충용액 + 생리식염수의 의미 인 것이다.

 

4. Buffer의 종류

1) Tris-Cl Buffer

염기성 성분인 Tris(tris-[hydroxymethyl]-aminomethane)를 사용하는 완충액이다. Tris는 많은 효소의 기질이 되지 않고 또 저해도 하지 않기 때문에, 이 pH 범위의 완충액으로 생화학적 연구에 폭넓게 사용되고 있다. Tris의 기본 구조는 지방족 제1아민이고, 염산 혹은 그 밖의 산으로 적정하는 것에 의해 유효 pH 범위 7.2~9.4의 완충액을 공급한다.

 

2) PBS(phospate buffered saline)

인산완충생리식염수로 평형염류용액의 일종인데, 생리식염수에 더욱 pH를 안정하게 유지할 수 있도록 인산염을 첨가한 용액이다. 사용목적에 따라 여러 가지 조성인 것을 사용하면서 세포세정, 분산 등의 세포를 사용한 실험뿐만 아니라 항체, 시약의 희석액으로서도 사용하고 있다. 또한 둘베코(Dulbeco)의 PBS(－) (둘베코의 염류용액에서 Ca2+와 Mg2+를 제거한 것)가 세포부유액용으로도 널리 사용하고 있다.

 

5. Buffer의 원리

완충용액은 pH의 변화를 완화시키는 역활을 한다. 원리를 살펴보면 완충용액은 용액안에 약산(weak acid) HA와 그 짝염기(conjugate base) A-가 평형상태를 이루고 있다. 이 때 어떤 종류의 강산(strong acid)이 들어오면 그 평형이 깨지게 되는데 이때 르샤틀리에의 원리(Le Chatelier's principle)에 의하여 평형반응이 깨지게 되고 HA가 생성되어 H+가 제거되는 쪽으로 반응이 진행된다. pH는 용액속의 수소이온(H+)의 농도를 측정하는 것이므로 완충용액은 수소이온(H+)의 농도가 증가하는 것을 막아 pH의 변화는 크게 일어 나지 않는다.

HA ↔ H+ + A-

예 ) 아세트산 CH3COOH과 그 짝염기 아세트산 나트륨 CH3COONa에 산을 넣는 경우

약산인 아세트 산은

식(1)

으로 해리되어 평형을 이루게 되지만 아세트산은 약산이므로 넣어주는 아세트산의 양에 비하여 해리되는 양이 매우적어 아세트산이온의 농도는 매우 작다.

그 짝염기인 아세트산 나트륨은

식(2)

으로 대부분이 해리된다. 이 두 용액을 섞으면 아세트산이온은 넣어준 아세트산 나트륨의 농도에 의하여 결정되며 외부에서 산을 넣어 수소 이온(H+)의 농도가 증가되면 (2)식에서 생긴 아세트산이온과 반응하여 수소이온(H+)이 제거되고 (1)식과 같은 형태가 되어 용액의 수소이온 농도는 거의 변하지 않게 된다.

예 ) 아세트산 CH3COOH과 그 짝염기 아세트산 나트륨 CH3COONa에 염기를 넣는 경우

식(3)

반대로 염기를 넣어 (OH-)를 넣게 되면 용액 속의 CH3COOH의 H+와 OH-가 반응을 하여 물(H2O)을 만들게되고 아세트산 이온이 생성된다. 이때 H+이온의 농도는 감소하므로 르 샤틀리에의 원리에 따라 아세트산이 이온화하여((1)식) H+를 생성하게 되므로 pH는 거의 일정하게 유지 된다.

실험 결과

1. 결과 분석

2, 10은 induced sample lysate이다. 두껍게 표시된 band는 target protein에 해당하고, 얇게 표시된 다른 band는 원래 박테리아가 가지고 있는 다른 protein들에 해당한다.

3~7, 11은 target protein purified sample이다. Target protein만 존재하기 때문에 그 부분만 매우 두꺼운 band로 표시된다.

9는 uninduced sample lysate이다. Operon이 작동되지 않아 발현되는 protein이 없어서 band가 표시되지 않는다.

 

토의 사항

 1. 실험 고찰

Bacteria를 transformation하여 protein을 발현시키면 여러 가지 이점이 있다. 많은 증식으로 원하는 실험을 자유롭게 할 수 있고, 다양한 vector를 선택 가능하다. 또한 operon을 통하여 gene expression을 쉽게 조절할 수 있다. 이 가운데 cell을 배양해서 삽입한 gene이 발현되도록 하여 protein을 얻는 과정을 induction이라고 한다.

Lac operon은 박테리아의 물질대사 시스템에서 lactose를 분해하는 효소를 만들어내는 시스템이다. 평소에는 가지고 있는 glucose를 사용하기 때문에 lac operon은 off되어 있다. 하지만 glucose가 없어지면 당을 얻기 위해 lac operon이 on되고 lactase가 만들어져 lactose를 통해 박테리아가 당을 섭취하게 된다.

Lac operon의 메커니즘은 다음과 같다. Lactose가 없을 경우, 조절 유전자에 의해 만들어진 lac repressor가 operator 결합하여 RNA polymerase가 promoter에 붙는 것을 방지하기 때문에 lactose가 분해되지 않는다. Lactose가 있을 경우에는 lactose가 lac repressor와 결합하여 operator에 결합하지 못하게 된다. RNA polymerase는 promoter에 결합할 수 있게 되어 lac 유전자가 발현되고 lactose가 분해된다.

평소에 lac operon은 promoter 다음 operator 위치에 repressor가 결합하고 있는 상태이다. 이 때 lactose를 넣어주면 repressor와 결합하여 lac operon 유전자로부터 떼어내게 되고, 이어 protein 합성이 일어난다. 따라서 삽입한 target protein이 발현되도록 하기 위해서는 lactose를 공급해야 한다. 하지만 lac operon에 의해 발현되는 protein은 lactose를 분해하는 효소가 있어서 문제가 된다.

Lactose와 비슷한 구조를 가지고 같은 기능을 보이는 화합물 중 대표적인 것이 바로 IPTG이다. 인공적인 화합물인 IPTG는 세포 내에서 분해가 되지 않아서 항상 같은 양의 발현을 유도할 수 있기 때문에 실험에서 inducer로 자주 사용된다. 이런 IPTG를 이용하여 targer protein을 얻어 protein의 구조와 기능 등의 정보를 파악할 수 있다.

DNA cloning과 마찬가지로 IPTG protocol에서도 vector의 lac operon뒤의 시퀀스에 원하는 target protein의 시퀀스를 붙여서 발현시킨다. 이 플라스미드를 박테리아에 넣어 계속해서 배양시켜주면 target protein을 대량으로 얻을 수 있게 된다. 따라서 IPTG를 넣어서 lac operon을 작동시키게 되면 시그널이 진행되어 target protein을 얻을 수 있게 되고, IPTG를 넣지 않으면 시그널이 진행되지 않기 때문에 target protein을 얻지 못하게 된다. 이렇게 해서 target protein이 잘 생성됐는지 SDS gel을 통해 확인한다.

SDS gel의 가장 왼쪽에는 protein의 크기를 가늠할 수 있도록 해주는 marker가 있다. IPTG를 넣은 박테리아와 넣지 않은 박테리아를 넣어서 로딩해주면, target protein은 IPTG를 넣은 쪽에서만 발현될 것이다. Gel은 upper gel, down gel 두 가지로 나누어져 있다. Upper gel은 로딩 속도 차로 인한 오차 문제를 해결해준다. Protein을 로딩해주는 속도가 다 다르기 때문에 중력에 의해 sample이 내려가게 되는데, 그렇게 되면 size의 차이로 protein을 정확하게 분별하기 어려워진다. 이런 점을 막기 위하여 upper gel은 protein이 동일 선상에 위치하여 일렬로 맞춰주는 역할을 한다. Down gel은 동일 선상에 위치했던 protein들을 size에 따라서 분리해준다.

실험 결과에서 얻은 gel을 보면 파랑색 band들을 확인할 수 있다. Induced sample lysate를 보면 target protein에 해당하는 band 부분은 두껍게 나오고, 박테리아가 가진 다른 protein들에 해당하는 부분도 얇은 band가 나온 것을 볼 수 있다. Uninduced sample lysate에서는 lac operon이 작동하지 않기 때문에 target protein을 얻을 수 없게 되고, 당연히 파란 band를 확인할 수 없다. Target protein만을 분리 정제한 target protein purified sample에서는 target protein에 해당하는 부분만이 매우 두꺼운 band로 생기게 된다. 이처럼 IPTG를 이용하여 lac operon의 매커니즘을 조절해 원하는 protein을 얻고, protein에 대한 정보를 얻을 수 있다.