[생명공학기초실험]PCR 실습

실험 목적

1. PCR에 대한 전반적인 지식을 쌓는다. 

2. PCR의 원리를 정확하게 이해하고 실습을 통해 복제시키려고 했던 특정 부위의 DNA가 증폭된 것을 확인해본다.

실험 이론 및 원리

1. PCR(Polymerase Chain Reaction) - 중합효소 연쇄 반응법

PCR은 프라이머와 내열성 DNA 중합효소를 이용하여 짧은 시간 내에 특정 DNA 조각을 증폭하는 방법으로서 현대 분자생물학의 가장 핵심적인 기술 중 하나로, 유전자 조작을 필요로 하는 분자생물학적 실험에는 물론, 병원성 미생물의 검출에 이르기까지 다양한 분야에서 활용되고 있다.

 

2. PCR의 원리

1) Denaturation(변성)

Double Strand인 DNA를 고온의 열로 Single Strand인 DNA로 분리시키는 과정으로, Denaturation이 진행되는 온도는 94~95℃ 정도이다.

 

2) Annealing(결합)

Denaturation이 일어나 Single strand로 풀어진 DNA에 상보적인 Primer가 결합하는 단계이다 (50~65℃). Primer의 sequence에 따라서 Annealing temperature(AT)가 변하며, 보통 한 쌍의 Primer 중 낮은 melting Temperature(Tm)의 -4~5℃를 AT로 잡는다.

 

3) Extension(신장)

DNA polymerase가 dNTP를 사용하여 Template에 상보적인 가닥을 합성하는 단계이다. 진행되는 온도는 70~72℃ 정도이다. Primer의 3′-OH 에서부터 시작하며, 사용되는 Polymerase 종류와 target하는 유전자의 크기에 따라서 시간은 임의로 조정가능하다. 일반적인 Taq polymerase의 경우 1Kbp 합성 시 60초면 충분히 합성이 가능하다.

3. PCR에서 Mg2+의 농도가 중요한 이유

일반적으로 PCR 반응에서는 1.5 ~ 2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실행할 때 ① 효소활성, ② primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④ primer-dimer의 형성 등에 관여하고 있다. 킬레이트제(예를 들면 EDTA)는 반응액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 전환하는 것에 주의할 필요가 있다. 

또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정2+확도에 영향을 미칠뿐만 아니라 두가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지 않다고 생각한다.

4. RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)

역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)의 변형으로, "증폭"이라 불리는 과정을 통해 많은 수의 DNA 서열을 만들기 위해 분자생물학에서 일반적으로 사용하는 실험기법이다. 그러나 역전사 중합효소연쇄반응에서는 RNA가 먼저 역전사 효소에 의해 역전사되어 cDNA를 만들고, 만들어진 cDNA가 기존의 중합효소연쇄반응이나 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 증폭된다. 

그 동안 형질 변환의 원인으로 DNA 염기 서열 변화와 재조합만 알려졌다. 그러나 DNA 염기 서열 변화 없이도 유전자 발현 패턴 및 유전자 발현의 활성화가 조절되고 이것이 다음 세대로 유전되는 현상이 발견되었다. 이 현상의 예로는 DNA 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 유비퀴틸화 등 여러 가지 형태가 있는데, 이들 중 DNA 메틸화(methylation)연구가 가장 잘 알려져 있다. 이에 대해 연구하는 학문이 후성유전학이다. 

위에서 언급한 methylation은 시토신(C)의 피리미딘 고리 C5 자리에 메틸기가 붙는 메틸화에 의해서도 유전자의 발현양상이 변한다. 이 반응은 시토신 뒤에 구아닌(G)이 올 때에만 일어나고 이를 CpG site라 한다. DNA 메틸기전달효소(DNMT)에 의해서만 매개되며 포유류에서 3 종류 (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b)가 존재하고, S-adenosyl-methionine이 메틸기 주개로 작용한다. 

이 배열에서 시토신이 메틸화 되는 경우가 많고, 인간게놈의 경우는 전체 시토신 중 3~5%가 메틸화 되어 있다. 이러한 CpG는 진화과정에서 그 비율이 점점 감소했고, 게놈에 존재하는 CpG의 메틸화 정도와 양상은 종에 따라 다르고, 조직에 따라서도 다른 특이성을 갖는다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) Taq DNA polymerase : 고온에서도 버틸 수 있는 DNA 중합효소로 초고열성 세균에서 유래되었다. 일반적으로는 PCR에서 Taq polymerase를 사용하는데, 이 중합효소는 DNA 합성속도가 빠르지만, 잘못 연결된 염기를 수정하지 못한다.

 

2) 10x Taq Buffer = PCR Buffer : DNA 증폭 반응에 최적으로 작용하는 pH와 Salt(염)을 제공한다. Buffer 내에 있는 Mg 이온은 특히 Polymerase의 효율을 높여주므로, 꼭 필요하다.

 

3) 10mM dNTP mix : dATP, dTTP, dGTP, dCTP의 총 4가지 deoyxnucleotide가 혼합되어 있는 상태로, 합성에 필요한 염기들을 제공한다.

 

4) Template DNA : genomic DNA : 증폭시킬 DNA 부분을 포함하고 있는 주형가닥을 말한다. Double strand나, RNA의 역전사를 통해 얻은 Complementary DNA(cDNA)에 모두 사용가능하다.

 

5) Primer mix : 10pmole/㎕ mix : Template에 상보적인 single strand nucleic acid로, PCR을 위해서는 Target하는 유전자의 앞부분(Forward)과 뒷부분(Reverse)에 대한 한 쌍의 Primer가 필요하다. 또한 Primer를 제작 할 때에는 수소결합이 상대적으로 강한 GC의 함유량과 이로 인한 Tm(Melt Point ; Melting Temperature)에 대한 정보가 필요하다. 대략적인 Tm 값은 {4*(G+C)}+{2*(A+T)} 로 계산할 수 있다.

 

6) H2O

 

7) PCR tubes & lids

실험 방법

1. 실험 과정

원래 실험은 + sample, - sample, R(random sample) 3개로 총 5개의 sample로 진행해야 하는데, 조별로 실험하기에 sample이 부족한 관계로 + sample, - sample, R(random sample) 총 3개의 sample로 실험을 진행하였다. 먼저 실험을 진행하기 전에 Master Mix에 있는 각각의 조성물에 3.2배씩 추가하여 하나의 tube에 모았다. 실험과정에서 loss가 생길 수 있는 점을 고려하여 3.2배씩 추가하였다.

 

1) DNA 및 다른 시료들을 준비하였다.

Taq DNA polymerase 10x Taq Buffer 10mM dNTP mix

Template DNA Primer mix H2O PCR tubes & lids

 

2) Master Mix를 만들었다.

Buffer : 2㎕ H2O : 14.45㎕ dNTP : 1.25㎕ Primer : 1㎕ Polymerase : 0.3㎕ DNA : 1㎕ 총 : 20㎕

× 3.2 →

Buffer : 6.4㎕ H2O : 46.2㎕ dNTP : 4㎕ Primer : 3.2㎕ Polymerase : 0.96㎕ DNA : 3.2㎕

 

그 후, ice 위에서 PCR tube에 각각의 sample이 오염되지 않도록 잘 넣어준다. 각각의 sample마다 DNA를 제외한 나머지 19㎕, DNA 1㎕ 순으로 총 20㎕를 넣어주었다.

 

3) 아래의 반응 조건에서 PCR을 수행하였다.

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험에서는 Master Mix를 만들 때 정량보다 많이 피펫으로 땄다. 그 이유로는

① 실험실의 피펫이 오래된 피펫이어서 피펫으로 옮길 때 시료가 덜 옮겨질 수 있다고 생각된다.

② 실험에서 필요한 시료의 양이 아주 적기 때문에 부착력에 의해 팁에 달라붙은 시료로 오차가 발생할 수 있다고 생각된다.

또한 각 염기간의 결합에 있어서 헤어핀 구조가 발생하는 것을 막기 위해 ice 위에서 진행하였는데, 각각의 sample에 DNA를 제외한 19㎕, DNA 1㎕를 옮길 때 각각의 sample이 담긴 PCR tube가 얼어서 정확한 양을 옮기지 못하는 문제가 발생했다.

 

참고 문헌

1. 남상욱외, 유전공학의 이해, 2016, 라이프사이언스.

2. User’s Guide for Polymerase Chain Reaction, 엘피스 바이오텍 PCR 실습