[일반생물학실험]탄수화물의 검출 및 소화효소 1부

실험 목적

화학적 반응실험을 통해서 탄수화물을 검정하고, 전분 가수분해 효소인 아밀라아제 (amylase)를 이용하여, pH 및 온도에 따른 효소 활성의 변화를 조사한다.

실험 이론 및 원리

1. 탄수화물

1) 탄수화물(carbohydrate)

탄수화물은 탄소, 수소 및 산소가 결합된 유기 화합물이다.

구 성 원 소	C : H : O = 1 : 2 : 1
구 조 식	Cm(H2O)n

 

2) 탄수화물의 생체 내 기능

① 구조다당류

생물체의 구성성분으로 구조를 유지하는 다당류를 구조다당류라고 한다. 물의 세포벽을 만드는 섬유소(cellulose), 곤충의 외피를 만드는 키틴(chitin), 동물의 연 골이나 힘줄의 성분인 황산콘드로이틴류(chondroitin sulfate) 등이 포함된다.

② 영양다당류

활동의 에너지원으로 생물체 내어 저장 된 다당류를 영양다당류라고 한다. 식물은 탄소동화작용을 함으로써 이산화탄소와 물로 포도당(glucose)을 합성한 후 녹말형태로 저장하고, 동물은 다른 생물에서 섭취하여 글리코겐(glycogen) 형태로 간에 저장한다.

 

3) 탄수화물의 종류

탄수화물을 구성하는 단위당의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분한다.

① 단당류

- 5탄당: 리보오스(ribose), 디옥시리보오스(deoxyribose)

- 6탄당: 포도당(glucise), 과당(fructose), 갈락토오스(galactose)

② 이당류(disaccharide)

두 개의 단당류를 탈수 반응에 의해 합성한 화합물로 두 개의 단당류가 글리코시드 결합을 통해 이루어진 것이다. 이당류 중에서도 알데히드기가 결합에 사용되지 않고 유리 상태로 있는 것은 환원성을 가진다, 단당류나 이당류는 모두 물에 잘 녹고 에테르에는 녹지 않으며, 어느 것이나 단 맛이 있다.

- 맥아당(Maltose): 포도당(glucose) + 포도당

- 설탕(Sucrose): 포도당 + 과당(fructose)

- 젖당(Lactose): 포도당 + 갈락토오스(galactose)

 

③ 다당류(Polysaccharide)

많은 단당류 (일반적으로 n=12이상)가 글리코시드 결합을 통해 하나의 분자를 이룬 당류를 말하며, 가수분해에 의해서 이당류 또는 단당류를 생성한다. 한 종류의 단당류로 구성된 것을 단순다당류라 하고, 여러 종류의 단당류로 구성된 것을 복합다당류라고 한다.

- 녹말(staech): 식물성 저장성분

- 글리코겐(glycogen): 동물성 저장성분

- 섬유소(cellulose): 세포벽 구성 성분

- 덱스트린(dextrine)

 

4) 글리코시드 결합(Glycoside bond)

글리코시드결합은 탄수화물 반응 중에서 가장 중요한 반응으로써 두 개의 단당류가 한쪽 단당류의 히드록시기와 다른 한쪽 단당류의 히드록시기에서 물 분자가 빠져나가는 탈수축 합반응을 말하며, 이때 산소를 매개로 한 다리가 만들어져 단당류들 사이의 결합이 이루어 진다.

 

2. 소화효소

1) 효소(enzyme)

화학반응은 반응 물질 외에 미량의 촉매가 존재함으로써 반응 속도의 영향을 받게 된다. 생물체내에도 촉매가 존재한다. 생물체내의 촉매는 대부분 구형단백질로 구성되며 이를 효소(enzyme)라고 부른다. 효소의 기능은 온도, pH(수소이온농도) 등 환경 조건에 따라 영향을 받는다. 효소는 화학적 촉매와 같이 반응 물질의 활성화 에너지(activation energy)를 낮추어 반응 속도를 촉진시킬 뿐, 자신은 화학반응에 관여 하지 않는다.

 

2) 효소의 구조

효소는 대부분 효소 작용을 받는 기질과의 결합부위인 촉매부위(catalytic site)를 갖는 고분자의 구형단백질이다.

 

그림 1. 글리코시드 결합

그림 2. 효소와 활성화 에너지

 

3) 효소의 특성

① 기질특이성(substrate specificity)

효소는 대부분 그 작용을 받는 특정 기질에 대해서만 강한 촉매반응을 나타내며, 다음의 두 유형으로 구분된다.

- 절대특이성 : 단 1가지 특정 기질에만 작용하는 효소

- 상대특이성 : 공통적인 특이구조를 갖는 몇 가지 기질에 모두 효소작용이 나타나는 경우

 

② 온도에 따른 활성화 정도

효소는 특정 온도 범위 내에서 활성이 가장 크게 나타나며, 대개 35~45℃에서 활성이 가장 크다. 이것은 온도가 올라가면 화학반응 속도가 일반적으로 커짐에 따라 효소의 촉매작용도 커지지만, 온도가 일정범위를 넘으면 화학반응 속도는 커져도 단백질의 분자구조가 변형을 일으켜 촉매기능이 떨어지기 때문이다.

그림 3. 온도 변화에 따른 효소의 활성도

그림 4. pH 변화에 따른 효소의 활성도

 

③ pH 변화에 따른 효소의 활성도 변화

효소의 활성은 단백질을 구성하고 있는 아미노산 곁사슬의 해리성군(COO-와 NH3+)에 따라 결정된다. pH는 효소 해리기의 상태를 변화 시켜, 특정 pH 수치에서 효소의 최대 활성을 보이게 하며, 기질에 해리성군이 있으면 이것도 같은 방식으로 효소 작용에 영향을 미친다. 대부분의 세포내 효소는 pH5~9 범위에서 최대 활성을 나타내지만 예외적으로 단백질 소화효소인 팹신의 경우에는 pH1~2에서 최대 활성을 나타낸다.

 

④ 효소의 작용 기작

효소(E)와 기질(S)이 결합하여 효소-기질복합체(ES)룰 형성하며, 이 복합체는 불안정하고 활성화 에너지가 적다. 그러므로 내부 분자구조가 쉽게 변형되어 반응생성물(P)과 효소(E)로 다시 분리된다. 즉, E + S ⇄ ES → E + P로 표현되며, 다음의 두 모델로 설명된다.

- 자물쇠 열쇠 모델(Lock-and-key model)

효소와 기질은 자물쇠와 열쇠의 관계처럼 서로 상보적인 구조로, 효소의 3차원적 촉매부위에 입체적으로 쪽 들어맞는 기질만이 결합하여 효소-기질 복합체를 형성한다.

- 유도 적합 모델(Induced fit model)

기질은 효소의 활성부위를 구성하는 아미노산 반응기들과 결합함으로써 효소분자의 입체구조를 변화시키게 되고, 그 결과로 촉매기능에 필수적인 특정 화학작용군이 기질에 근접하면서 기질 분자와 결합하게 된다.

그림 5. 효소의 작용 기작

 

3. 가설 설정(Setting up hypothesis)

1) 베네딕트 검사로 탄수화물을 검출할 수 있을 것이다.

2) 바포오드 검사로 탄수화물을 검출할 수 있을 것이다.

3) 온도에 따라 아밀라아제의 활성 정도가 달라질 것이다.

4) pH에 따라 아밀라아제의 활성 정도가 달라질 것이다.

 

4. 실험 포인트

1) 단백질의 구조: 생물의 몸체를 이루고 있는 고분자 유기물. 수많은 아미노산의 연결체이다. 천연 아미노산에는 20종류가 있는데, 이 아미노산들이 펩티드 결합으로 연결된 것을 폴리펩티드라고 한다. 단백질과 폴리펩티드는 같은 말이지만, 보통 분자량이 비교적 작으면 폴리펩티드라 하고 분자량이 매우 크면 단백질이라고 한다.

2) 단백질의 기능: 화학반응의 촉매, 면역을 담당, 물질의 운송이나 저장산물의 역할을 함, 세포의 운동성을 결정, 세포의지지, 세포 밖의 자극 감지, 세포의 생장과 분화 조절 등을 한다.

3) 닌히드린 반응: 단백질 발색 반응의 하나로서, 단백질의 중성용액 소량을 물에 녹인 수용액에 닌히드린 몇 방울을 넣어서 끓였다가 식히면 청자색으로 된다. 이 반응을 나타내는 것은 유리된 카복시기 및 유리된 아미노기를 적어도 1개 가진 아미노산, 폴리펩타이드 및 단백질이다.

4) 뷰렛반응: 단백질이나 펩티드를 검출하는 반응으로 뷰렛구조가 2가의 구리 이온과 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하여 용액의 색깔이 보라색으로 변하는 특성을 이용한다. 단백질 뿐 아니라 단 몇 개의 펩티드 결합을 가지고 있는 펩티드도 뷰렛반응을 통해 검출할 수 있다

5) 단백질의 소화: 단백질은 이자효소에 의해 1/3은 아미노산이 되고 나머지 2/3는 아미노산 수치가 2~6인 작은 펩티드(peptide)가 된다. 그 아미노산은 솔 가장자리 막에 존재하는 각각의 아미노산에 대응하는 운반체를 매개로 하여 작은창자 상피세포내로 흡수된다. 작은 펩티드는 한편으로는 솔 가장자리 막 위의 펩티다아제에 의해 다시 소화되어 아미노산이나 더 작은 펩티드가 된다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료(Materials)

1) 탄수화물의 검출

① 베네딕트검사(Benedict's test)/ 바포오드검사(Barfoed's test)

1% glucose	1% sucrose	1% maltose
1% starch	1% fructose	베네딕트용액
바포오드용액	시험관대	시험관
중탕기	눈금스포이드

 

2) 소화효소

② 아밀라아제의 활성과 온도의 효과 / 아밀라아제의 활성과 pH의 효과

1% starch	완충용액(pH 4, 7, 10)	요오드용액
눈금스포이드	시험관	시험관대
중탕기	얼음	온도계
종이컵	피펫	1% 아밀라아제

 

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