[일반생물학실험]탄수화물의 검출 및 소화효소 2부

실험 방법

1. 탄수화물의 검출

1) 베네딕트 검사(Benedict's test)

① 베네딕트액 2㎖를 5개의 시험관에 넣고, 각각 시료 0.5㎖(10방울정도)를 가한다.

② 이것을 3분간 끓는 물에 중탕시킨다.

③ 과제 : 서서히 식히면서 나타난 침전물의 색을 관찰한다.

 

2) 바포오드 검사(Barfoed's test)

① 바포오드액 5㎖를 5개의 시험관에 넣고, 각각 시료 0.5㎖을 가한다.

② 이것은 2분간 끓는 물에 중탕시킨다.

③ 과제 : 서서히 식히면서 나타난 반응결과(침전물의 색)을 관찰한다.

 

2. 소화 효소

1) 아밀라이제의 활성과 pH의 효과

① 3개의 시험관에 각각 pH4, pH7, pH10의 완충용액을 2㎖씩 넣고, 1% starch 4㎖를 첨가한다(1% starch를 넣을 때 항상 흔들어서 넣는다).

② 완충용액과 1% starch가 들어있는 시험관에 1% 아밀라아제를 1㎖씩 넣고 잘 흔들

준 뒤, 각각 다른 2개의 시험관에 2~3㎖씩 옮겨 담아, 전부 9개의 실험관 액을 만든 다.

 

과제

① 5분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

② 10분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

③ 15분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

 

2) 아밀라이제의 활성과 온도의 효과

① 1% starch를 6㎖씩을 각각 3개의 시험관에 넣고, 1% 아밀라아제를 1㎖씩 첨가한다. 잘 흔들어 준 뒤 각각 다른 2개의 시험관에 2~3㎖씩 옮겨 담는다(1% starch를 넣을 때 항상 흔들어서 넣는다).

② 전부 9개의 실험관 액을 만들고, 0℃(ice), 37℃, 90℃의 중탕기에 3개씩 놓는다(Working solution tube 9개).

 

과제

① 5분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

② 10분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

③ 15분 후 요오드용액 1방울을 떨어뜨리고 잘 흔들어 그 색깔을 관찰 비교한다.

주의 사항

1. 2개 조가 한 팀이 되어 실험한다.

2. 실험 전 시험관이 깨끗한지 확인 후 실험을 시작한다.

3. 색을 관찰, 비교해야 하므로 결과정리 전에 실험 반응물을 버리는 일이 없도록 주의 한다. 결과 정리 후 반응물은 폐액 비커에 모은 후 노란색 폐액통에 버린다.

4. 아밀라아제가 활성화되면 요오드 본래의 색깔이 나타나지만, 활성화되지 않으면 전분 과 요오드가 반응하여 보라색을 나타낸다.

5. 실험에 사용한 시험관은 솔과 세제를 사용하여 깨끗이 세척한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

ⓐ 베네딕트 검사 좌측부터 fructose, starch, maltose, sucrose, glucose 이다. 환원성이 있는 당에만 선택적으로 반응하였다. 1% glucose는 녹황색으로, 1% fructose는 주황색으로, 1% maltose는 녹황색으로 색깔이 변했다. 1% sucrose, 1% starch는 색깔 변화가 없었다.

ⓑ 바포오드 검사 좌측부터 glucose, starch, maltose, sucrose, fructose, 이다. 주로 단당류에 의해서만 환원이 된다. 1% glucose와 1% fructose는 Cu2O인 짙은 빨강색의 반응 침전물이 생겨야 하는데 이번 실험에서는 그런 반응이 보이지 않고, 동일하게 푸른색을 유지하였다.

ⓒ 아밀라아제의 활성과 온도의 효과 (5분 후) 좌측부터 0℃, 37℃, 90℃에 5분 동안 놓고, 요오드용액을 1방울 떨어뜨린 결과이다.

ⓓ 아밀라아제의 활성과 온도의 효과(10분 후) 좌측부터 0℃, 37℃, 90℃에 10분 동안 놓고, 요오드용액을 1방울 떨어뜨린 결과이다.

 

ⓔ 아밀라아제의 활성과 온도의 변화 (15분 후) 좌측부터 0℃, 37℃, 90℃에 15분 동안 놓고, 요오드용액을 1방울 떨어뜨린 결과이다.

ⓕ 아밀라아제의 활성과 pH의 효과 (5분 후) 좌측부터 3개씩 pH 4, pH 7, pH 10 이다. 5분 후 요오드용액 1방울 떨어뜨린 결과이다.

Ⓖ 아밀라아제의 활성과 pH의 효과 (10분 후) 좌측부터 3개씩 pH 4, pH 7, pH 10 이다. 10분 후 요오드용액 1방울 떨어뜨린 결과이다.

Ⓗ 아밀라아제의 활성과 pH의 효과 (15분 후) 좌측부터 3개씩 pH 4, pH 7, pH 10 이다. 15분 후 요오드용액 1방울 떨어뜨린 결과이다.

 

표 1. 탄수화물의 검출 결과

Test	단당류 1% glucose/1% fructose	이당류 1% maltose/1%sucrose	다당류 1% starch
Benedict	녹황/적색	주황/∙	∙
Barfoed	짙은 빨강색 (적색 계열)	∙	∙

 

표 2. 아밀라아제의 활성과 온도

온도(℃)/시간(분)	5	10	15	20
0	진한 보라색	진한 보라색	진한 보라색	진한 보라색
37	노란색	노란색	노란색	노란색
90	진한 보라색	진한 보라색	진한 보라색	진한 보라색

 

표 3. 아밀라아제의 활성과 pH

pH변화/시간(분)	5	10	15	20
pH 4	진한 황색	진한 황색	진한 황색	진한 황색
pH 7	노란색	노란색	노란색	노란색
pH 10	진한 황색	진한 황색	진한 황색	진한 황색

결과: 표 1과 표 2의 내용은 참고 문헌값이다. 실험결과에서 다 검은색으로 나왔기 때문이다. 자세한 내용은 고찰에 적었다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

베네딕트 검사를 통해 베네딕트용액과 포도당의 반응을 이용해 포도당이 있는지 여부를 알 수 있었다. 이 검사의 원리를 조사해 보았다. 베네딕트용액에는 2가의 구리이온(Cu2+)이 포함되어 있다. 2가의 구리 이온은 청록색을 띠기 때문에 베네딕트용액의 색깔은 청록색을 띤다. 그런데, 만약 베네딕트 용액 속의 구리 이온이 환원되어 전자를 얻으면 1가의 구리 이온(Cu+)이 되고 용액의 색깔도 바뀔 것이다. 

포도당은 환원력을 갖고 있는 분자이기 때문에 다른 물질로부터 전자를 빼앗겨 자신은 산화되고 다른 물질을 환원시키는 능력이 뛰어나다. 즉, 베네딕트 용액과 반응하여 2가의 구리 이온을 환원시킬 수 있는 것이다. 따라서 베네딕트 용액과 포도당을 섞고 가열하면, 포도당이 베네딕트용액의 2가 구리 이온(Cu2+)에 전자를 주어 환원시키고, 1가의 구리 이온(Cu+)을 만든다. 이 때 산화구리(Cu2O) 침전물이 생기면서 용액의 색깔을 황적색으로 변화시키게 된다.

바포오드 검사에서는 초산동을 초산에 용해시킨 Barfoed 용액에 당을 가하여 가열을 하게 되면 단당류의 경우 Cu2O인 이산화동의 적색 침전을 일으키게 된다. 이 검사의 원리를 조사하였다. 바포오드가 약한 산성을 가지고 있기 때문에 단당류에서만 반응을 한다. 따라서 이 검사는 단당류와 이당류를 구별할 때 사용하는 것으로 바포오드용액에 의해 이당류가 구리이온으로 Cu2O로 환원시키지 못하는 원리를 이용하여 단당류와 이당류를 구별한다. 이번 실험에서는 동일하게 푸른색을 유지하였고, 적색 침전 현상을 보지 못하였다. 이 실험은 다른 조가 실험하여서 자세하게는 모르겠지만 재료의 문제, 용액 양의 문제 등이 이러한 실험 결과를 초래했다고 예상해본다. 다음에 다시 실험하여 이와 같은 원리와 동일한 실험 결과를 얻었으면 한다.

아밀라아제의 활성과 pH의 효과와 아밀라아제의 활성과 온도의 효과에 대한 실험에서는 결과를 확인하기 어려웠다. pH의 효과 실험은 우리가 직접 실험 한 것이 아니고, 2조가 실험 후 사진을 전달받았다. 하지만 두 실험 사진에서 다 검은색으로 나타나있었다. 우선 pH실험은 책을 참조한 결과에서는 pH 7에서 최대 활성을 보이고, 시간이 경과함에 노란색이 옅어짐이라 보고되어 있었다. 온도 실험의 결과는 37℃에서 최대의 활성을 보이고, 90℃에서 아밀라아제가 변성을 일으켜 활성이 매우 낮은 것으로 보인다 라고 보고되어 있었다. 그런데 우리는 왜 다 검은색으로 나타났는지 궁금하였다. 네이버 백과사전으로 조사하였을 때 문제 상황이 3가지가 나왔다. 

우선 amylase는 a-amylase와 glucoamylase가 있다. 전자는 녹말의 긴 사슬을 중간 중간 끊어주는 역할을 하고 후자는 끊어진 사슬을 포도당으로 바꾸는 역할을 한다. 효소는 두 가지를 같이 넣어야 한다. 적어도 전자는 들어가야 녹말이 분해되고, 후자만 넣어서는 녹말을 분해할 수 없다. 그러므로 효소의 종류를 확인 했어야 한다. 또는 완전히 반응하기 전에 요오드를 넣은 것에도 문제가 생길 수 있다. 분자량이 높은 다른 다당류를 검출했을 수도 있다. 효소의 양이 적거나 효소활성에 비해 충분히 반응을 안 시켜 주었을 수도 있다. 그래서 완전히 포도당으로 끊어지기 전에 긴사슬인 상태로 측정했을 수도 있다. 

또 한 가지는 요오드의 농도가 너무 진했을 수도 있다. 따라서 색깔의 변화확인을 하기 힘들었을 수도 있다는 것을 확인 하였다. 그래서 결과가 다 검은색으로 나타났음의 이유를 확인하였다. 만약 실험이 정상적으로 이루어졌다면 pH실험에서 노란색이 옅어지는 이유를 조사하였을 것이다. 책을 참고해서 결과에 덧붙이자면 요오드 녹말반응은 요오드 용액이 녹말과 반응하여 청 남색으로 변하는 반응이다. 

변하는 이유는 요오드 용액 속에는 요오드와 요오드화이온이 함께 있어 그 두 물질이 결합한 착이온 I3-가 녹말의 나선형사슬 안에 들어가서 나타내는 색인 것이다. 그러나 만약 어떤 물질이 I3- 나 I5-가 생기는 것을 방해하면 이 반응은 일어나지 않는다. 예를 들어, 비타민 C의 경우 워낙 산화가 잘 되는 물질이라서 요오드 용액과 반응하면 자신이 산화되면서 요오드를 환원시켜 I3- 나 I5-기지 못하게 되므로 다시 무색으로 돌아온다.

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