[일반생물학실험]Transformation - 원핵생물 실험

실험 목적

E.coli의 transformation 실험을 통해서 유전 공학에 많이 쓰이는 transformation의 기작을 이해하고, 그 방법을 익힌다.

실험 이론 및 원리

1. 형질 전환(TRANSFORMATION)

수용세포에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정을 나타내며 몇몇의 박테리아 사이에서 자연적으로 일어나는 현상이다 (예로 Stretococcus와 Bacillus). 대장균을 포함한 다른 종은 외부DNA를 흡수할 능력이 없다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다. 움직이게 할 수 있는 DNA의 2번째 방법인 형질전환은 1928년 Fred Griffith에 의해 발견되었다.

형질전환은 유전자 형태에서 수용성 Chromosome의 분자 중간물과 합성된 물질인 드러난 DNA분자나 단편에서 이루어진다. 자연적인 DNA형질전환은 박테리아를 줌으로써 온다. 이 과정은 무한적이며 유전자의 어떤 부분도 박테리아 사이에서 형질전환 될 것이다. 박테리아가 섞이면 그들은 주위환경의 대부분의 DNA를 풀어놓는다. 이 단편들은 아마도 비교적 크고 여러 유전자를 내포하고 있다. 만약 이 단편이 반응성이 있는 세포와 접촉하면 DNA를 끌어들여 형질전환을 할 수도 있다.

비교적 DNA의 고농축은 정상적으로 자연 속에 제공되는 보다 높은 형질전환의 횟수 증가로 이용된다. 직선의 DNA조각들은 형질전환으로 사용할 때 E. coli는 대개 형질전환 하는 조각을 보호하기 위해 exonuclease활성을 만든다. 플라스미드는 직선 조각으로 쉽게 퇴화할 수 없기 때문에 숙주 안에서 복제될 수 있으며 플라스미드 DNA에서 박테리아로 형질전환하기 훨씬 쉬워진다. 이것은 박테리아 세포로 DNA을 재조합 하는 일반적인 방법이다. 어떤 원천으로부터 DNA는 형질전환하기 전에 플라스미드 DNA가 재접합 함으로써 안으로 끼워 넣을 수 있다.

 

2. VECTOR

DNA의 이동을 담당하여 원하는 염색체를 실어서 보내서 DNA를 다른 세포에서 복제될 수 있도록 하는 유전 요소를 말한다. 따라서 VECTOR는 복제가 되어야 하고 유전자이송을 담당하므로 복제가 되어야하고 유전자를 넣을 수 있어야 한다.

1) VECTOR의 기능

① 세포 내에서의 자가복제(self-replication)기능

Vector로 쓰는 DNA들은 세포 내 에서 자가복제를 한다. 박테리아 세포 내에는 박테리 아가 고유하게 가지고 있는 chromosomal DNA가 있다. 한 세포당 하나밖에 있을 수 없 다. 그런데 vector는 한 세포 내 에서도 스스로 복제하여 수많은 copy가 존재할 수 있다.

②항생제를 이용한 선택(selection) 이 가능

Vector에 존재하는 항생제 내성 유전자를 이용하면 DNA가 세포 내로 주입되었는지 아 닌지를 판별할 수 있다. Gene cloning에서는 내가 원하는 유전자가 세포 속으로 들어갔는 지가 중요하기 때문에 이런 기능은 필수적이라고 할 수 있다. 이렇게 해서 세포 속으로 DNA가 들어간 세포만을 선별하는 것을 selection이라고 한다.

③ Multiple cloning site(MCS)를 이용가능 하게 하는 기능

실험실에서 사용하는 vector는 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분이 있어서 cloning에 용이하다. 때로는 이 부분을 이용하여 자신이 원하는 construct를 자유자재로 만들 수도 있다. Multiple cloning site가 없는 vector는 이용 가치가 거의 없다.

④ Vector 부위를 이용한 DNA sequencing, 단백질 발현 등을 가능하게 함

Vector에 존재하는 염기서열을 이용한 DNA sequencing을 하기도 편하고, vector에 달린 여러 부분을 이용하여 단백질발현을 할 수도 있다. 이런 이유로 해서 원하는 유전자를 vector에 삽입하는 것이 필요하다.

 

3. pUC18

pUC18는 dideoxy법에 의한 DNA sequencing에 적당한 plasmid vector로 M13 phage vector에 비교하여 큰 DNA 단편을 cloning할 수 있다. lacZ 영역에 multi-cloning site를 갖고 있어 IPTG 와 X-gal을 함유하는 plate에서 외래 DNA의 삽입 유무를 간단히 판별할 수 있다. 또 lac promoter를 이용한 외래 유전자의 발현도 가능하다.

 

4. LACTOSE OPERON

Jacob과 Monod가 transcriptionally regulated system을 설명한 최초의 operon. E. coli에서 lactose 분해대사에 관련된 유전자 집단이다. 박테리아가 lactose가 존재하는 환경에 처할 때 lactose를 분해하는데 필요한 enzyme을 합성하기 시작한다.

1) structural gene

① beta-galactosidase (lacZ) : lactose를 glucose와 galactose로 가수분해한다.

② lactose permease (lacY) : 외부에 존재하는 lactose를 cell 안으로 transport하는 transmembrane protein

③ galactoside transacetylase (lacA) : no known function

 

2) regulatory gene

① lac repressor (lacI) : lactose가 존재하지 않을 때 operator DNA site에 결합하여 lac operon의 transcription을 repress하는 단백질

② lac promoter (lacP): RNA polymerase가 lac operon에 binding하는 site

③ lac operator (lacO): lac repressor가 binding하는 DNA site

④ Pi: lacI의 promoter

⑤ CAP : cAMP/CAP complex의 binding site

3) Lactose

lac operon을 작동시키는 inducer로 작용, lac operon은 inducible lactose를 induction실험에 잘 사용하지 않는 이유는 beta-galactosidase가 lactose를 분해하여 lactose 농도를 감소시키기 때문이며 대신 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 gratuitous inducer (inducer로 작용하지만 substrate로는 사용되지 않는 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 gratuitous inducer로 사용한다.

• Reaction

① lac operon in action

lactose가 존재할 때 operon에 대하여 inducer로 작용한다. cell내로 들어가 Lac repressor에 결합하여 repressor의 구조를 변화시켜 repressor가 DNA 로부터 떨어져 나가도록 한다. 이때 RNA polymerase는 DNA상을 이동할 수 있어 세 유전자에 해당하는 RNA (poly cistronic m RNA )를 합성한다.

② lac operon is off

inducer (lactose)가 제거되면 repressor는 원래의 형태로 되돌아 와 DNA (operator site)에 결합하여 RNA polymerase가 promoter부위를 통과하지 못하도록 한다. RNA와 protein이 만들어지지 않는다.

③ catabolite repression

세포내 glucose (catabolite)의 농도가 높으면 cAMP합성이 저해된다. 반대로 glucose 농도가 낮아지면 cAMP의 양이 많아진다. cAMP는 CAP (catabolite activator protein) 단백질과 complex를 이뤄 CAP binding site에 결합, RNA polymerase의 affinity를 증가시킴으로써 transcription을 활성화한다. 이 현상을 catabolite repression이라 한다.

 

5. IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactoside)

IPTG는 β-galactosidase의 활성의 유도물질이다. 따라서 lacZ 결손세포를 숙주로 하여 pUC계 plasmid vector DNA를 형질전환 할 때나, M13 phage vector DNA를 형질도입 할 때 배지에 IPTG 와 X-gal을 첨가하여 놓으면 β-galactosidase 의 α-상보성에 의한 발색의 유무로 간편하게 재조합체를 선택할 수 있다. 또 lac promoter나 tac promoter를 갖는 발현 vector의 발현 유도제로서 사용한다.

IPTG의 구조

 

실험 방법

1. Transformation

1) 미리 준비해 둔 competent cell(BL21, DH5a)을 10㎕씩 각각의 Eppendorf tube에 분주한다

2) 여기에 다음의 DNA(NF-L) 0.2ng/1㎕씩 각각 넣어주고 gently mix

3) 얼음에서 30분동안 보관한다.

4) tube를 42℃ water bath로 옮겨 정확히 30초(do not shake)

5) 얼음에서 2분동안 chilling 시킨다.

6) tube에 SOC media를 첨가하고 room temperature(37℃)에서 60분 동안 shaking incubati on(SOC의 양 BL21-40㎕) → eppendolf tube 이용

7) tube에서 50㎕를 취해 LB+Kan plate에 spreading한다.(spreading 전에 tube를 gently mix)

8) Incubation 37℃ 12시간 overnight

9) 하나의 colony를 10㎕ tip으로 집는다(살짝 건드리는 정도로 따로 떨어져 있고 크기가 퍼지거나 너무 작은 것은 피한다. 밀집된 colony는 toxic해져 사용하지 않는다.)

10) Seed : 3㎖의 LA(액체배지)에 넣고 shaking 하며 room temperature incubation(LA에 tip 그대로 넣는다)

 

2. Induction

1) IPTG 8㎖ 처리 후 3시간 culture

2) 3hr shaking 하며 room tempertaure incubation

 

실험 결과 및 토의

1. 결과 분석

induction을 통한 protein의 expression이 잘 되었는지 눈으로 명확하게 확인할 수 는 없었다. IPTG를 처리해준 tube를 IPTG를 처리하지 않은 tube와 비교하였을 때 약간의 색의 변화를 볼 수 있었다.

2. 실험 고찰

본 실험은 transformation 후에 IPTG를 이용하여 protein을 induction하는 방법을 습득하는 것 이였다. 배양하는 시간을 기다리는 것이 오래 걸렸지만 의외로 실험방법은 간단하다고 볼 수 있었다. transformation 하는 동중에 12hr overnight 하는 과정이 있는데 시간상 꺼냈다 뺐다를 반복하면서 배양시켜 잘 배양될 수 있을까 걱정되었지만 다행이도 colony를 관찰할 수 있었다.

induction이란 promter에 IPTG를 넣어주어서 mRNA를 expression 시키는 과정으로 induction을 통해서 protein을 만들 수 있다. 여기에서 IPTG는 protein을 만들기 위해서mRNA를 과발현시키는 것이다. 먼저 transform된 E. coli를 overnight culture한 것을 LA배지와 함께 삼각플라스크에 넣어줄 때 반드시 알코올램프 옆에서 실시하여 오염이 되지 않도록 주의를 기울여야한다. 실험에서 induction 시키기 위해서 tranform된 E.coli와 LA를 삼각플라스크에 넣고 shaking incubator에서 배양하여 OD를 1.0~1.2가 되도록 해야한다. 왜냐하면 induction 하기에 적당한 OD가 1.0~1.2이기 때문이다. 그러나 shaking incubator에서 배양을 잘 해야 OD를 잘 맞출 수 있기에 신중해서 배양해야한다. 

그리고induction을 할때는 shaking incubator의 온도를 30℃로 유지시켜야 한는 것을 잊지 말아야 한다. 왜냐하면 OD를 측정하기 위해 shaking incubator의 온도를 37℃로 설정해 두었기 때문이다. 이번실험은 위의 내용만 주의를 기울인다면 매우 만족스러운 결과를 e을 수 있다고 본다. 물론 실험 전 과정에서 주의를 기울여야 하지만 특히 위 내용에 주의를 기울일 필요가 있다. 지금까지의 실험결과가 잘 되 었는지 계속된 실험을 통해서만 알 수 있으며, 눈으로는 정확히 확인할 수 없다. 현재로서는 tube의 아래쪽의 색이 희미하게 조금 변했기 때문에 실험이 잘되고 있다고 추측할 수 있다.

물론, 실험과정에서 오염이 되어 실험이 잘못될 수도 있지만 그러한 가능성은 적다고 본다. 그렇기 때문에 현재까지의 실험결과는 만족스럽다. 일단 실험이 잘 되어서 단백질이 만들어졌다는 전제로 다음실험을 실시하게 되는데, 만족스러운 실험결과가 나올 수 있도록 실수 없이 실험에 신중을 기해 임해야 겠다.

 

참고 문헌

1. Lodish, Baltimore, Berk, Zipursky, Matsudaira, Darnell, Molecular Cell Biology, Third edition(1995), Scientific American Books, NewYork

2. Brock 대학 미생물학, madigan외 3인, 탐구당, p.399~493