[일반생물학실험]단백질 분리정제 및 기능분석 - buffer 만들기

실험 목적

1M의 TRIS-HCl(pH 7.4), NaCl, MgSO4 Stock solution을 제조한 후 다양한 NaCl농도의 elution buffer를 만든다.

 

실험 이론 및 원리

1. Buffer

1) 완충 용액(buffer solution)

산이나 염기가 약간 첨가되어도 pH가 거의 변하지 않는 용액을 말한다. 전형적으로 완충용액은 약산과 그 짝염기를 대략 같은 농도로 섞어 만든다. 완충용액은 용액에서 이온의 용해도를 조절할 때나 생화학적, 생리적 과정에서 pH를 유지할 때 중요한 역할을 한다.

 

2) buffer의 작용 원리

산 또는 염기만 과량 녹아 있는 용액의 경우 외부에서 강산이 들어오면 그 양만큼의 염기 이온(A-)이 양성자화되고, 강염기가 들어오면 그 양만큼의 산(HA)가 이온화되면서 [HA]:[A-]의 비가 크게 변하게 된다. 반면, buffer에서는 HA와 A 을 이미 비슷한 양을 가지고 있기 때문에, 강산 또는 강염기가 들어온다 하더라도 반응이 거의 진행되지 못하므로 [HA]:[A-]가 거의 일정하게 유지된다. 이로 인해 pH가 거의 일정하게 유지된다고 보면 된다.

 

2. 몰농도

몰농도 = 용질의 몰수/용액의 L수 = ㏖L-1

"M"은 ㏖L-1의 약자이다. 0.1M(0.1 몰농도로 읽음) HCl 용액에는 용액 1L당 0.1몰의 HCl(물론 이온으로 해리되어 있지만)이 있다. 몰농도는 묽은 용액의 조성을 기술하는 가장 흔한 방법이다. 그러나 몰농도는 온도에 따라 약간 변하는 결점이 있어 농도를 정확하게 계산하는데 적당하지 않다. 용액은 가열하거나 냉각시키면 부피가 변하므로 몰농도 또한 변한다.

 

3. pH Meter의 사용법

1) 검출부를 보존용액에서 꺼내 증류수로 깨끗이 씻는다.

2) 기기의 Calibration 버튼을 누른다.

3) 지시부에 Cal 1이 뜨면 검출부를 pH 4.01 표준용액에 담그고, 지시부의 숫자가 4.01로 고정될 때까지 기다린다.

4) 고정되면 다시 Calibration 버튼을 눌러 지시부의 Cal 1이 Cal 2로 바뀌는지 확인한다.

5) 증류수로 씻어낸 검출부를 pH 7 표준용액에 담그고 지시부의 숫자가 7로 고정될 때까지 기다린다.

6) 고정되면 기기의 Measure 버튼을 누르고 검출부를 증류수로 씻어낸 후 측정하려는 용액에 넣고 지시부의 pH를 읽는다.

 

4. pH Meter 사용시 주의 사항

1) 검출부의 유리 전극은 충격에 매우 약하므로 닦거나 Calibration 과정중이나 용액의 pH 측정 시에 깨지지 않도록 주의해야 한다.

2) 다른 용액에 검출부를 넣을 때엔 깨끗이 씻어 용액이 서로 섞이거나 pH가 잘못 측정되지 않도록 한다.

3) Calibration과정은 꼭 두 가지 이상의 표준용액을 통해서 검출부를 통해 측정되는 값과 pH가 선형그래프를 그려 측정 용액의 pH를 알 수 있도록 한다.

 

5. Alkaline phosphatase의 성질과 정제법

1) Alkaline phosphatase(AP)의 성질

① homodimer 상태로 존재 : 160-180kDa

② Charge : ㊀charge

③ Solubility : water or lipid soluble

④ Stability : 75~85℃에서도 activity 유지

⑤ Specific function : alkaline condition

 

2) AP purification(E.coli 기준)

① Tube에 E.coli cell을 넣고, osmotic shock를 가해 outer membrane을 파괴시켜 AP가 포함되어 있는 spheroplast가 되게 한다.

② 원심분리를 통해 AP가 포함된 상층부와 pellet을 분리시킨다.

③ 상층액을 10kDa 크기의 구멍이 있는 반투과성 막 주머니에 넣고 기본 buffer에 넣 어 분리시킨다.(AP는 160~180kDa이므로 주머니 안에 존재)

④주머니 안의 용액을 옮겨 heat shock를 가해 AP를 inactivate상태로 만든 뒤, column chromatography 과정을 통해 정제한다.

 

6. Ion-Exchange Chromatography(DEAE)

1) DEAE

DEAE(다이에틸아미노에틸 셀룰로스, Diethylaminoethyl cellulose)는 이온교환수지(Ion Exchange chromatography)에 의해 단백질을 정제하는 과정에서 pI(등전점)보다 높은 pH에서의 단백질의 순 전하(net charge)가 음일 경우 사용되는 sepharose이다. 단백질을 핵산과 분리 정제할 때 사용되는 크로마토그래피 기법에 이용된다. DEAE는 (+) 전하를 띄고 있어서 주로 음전하를 띈 단백질들과 결합한다. 그 이유는 DEAE 구조 안에 있는 N+때문이다.

 

2) DEAE를 이용한 ion Exchange Chromatography

DEAE의 전기적 성질을 이용하여 양전하와 음전하를 띈 단백질을 DEAE에 통과시켜 음전하를 띈 단백질들을 붙잡게 한다. 그리고 결합된 단백질은 다른 방법으로 분리한다. 이를 음이온 교환수지(anion exchange chromatography)라 한다. 반대로 pI보다 낮은 pH에서는 순 전하가 positive(+)하므로, 음전하 집단이 붙어 있는 수지(resin), 예를 들어 CM(carboxymethyl, -CH2COO-)에 결합시켜 분리한다. 이를 양이온 교환수지(cation exchange chromatography)라 한다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

1) 마이크로피펫, 마이크로피펫 팁, pH미터, 씻기병, 교반기, 마그네틱 바

2) 전자저울, 비커, 코니칼튜브

2. 실험 시약

1) 증류수(3차), TRIS, HCl 수용액, pH 표준용액(4.01, 7) 

실험 방법

1. Column Chromatography의 준비로서의 buffer 만들기

1) 50㎖의 1M TRIS(M.w.=121.14g/㏖) 용액을 만드는 데 필요한 용질의 질량을 계산한다.

2) TRIS를 비커에 넣고 30㎖의 증류수를 채운 후, 교반기를 이용해 충분히 용해시킨다. 이 때 마그네틱 바가 비커 벽면에 닿지 않게 조정한다.

3) pH 4.01, 7의 표준용액을 이용해 pH미터 Calibration 과정을 거친다.

4) 교반기 위에 2번 과정에서 만든 용액을 올려놓고, pH미터의 검출부를 비커 안에 넣어 pH를 측정하며 HCl을 마이크로피펫을 이용해 조금씩 넣는다. 이때 검출부와 회전하는 마그네틱 바가 닿지 않게 하고, 염산 기체를 흡입하는 것은 위험하므로 뚜껑을 빨리 여닫는다.

5) pH 7.4가 되면 교반기와 pH미터의 전원을 끄고 용액을 코니칼튜브에 옮겨 담는다.

6) 마이크로피펫을 이용해 5번 용액이 총 50㎖가 되도록 증류수를 채워 넣는다.

 

실험 결과

1. 결과 data

1) 실험방법의 1번 과정에서의 TRIS 질량

몰농도 = 용질몰수/용액 L수이고, 용질의 몰 수는 질량/분자량이므로,

질량 = (용액 L수×분자량)/몰수 식에 몰 수=1M, 용액의 부피=0.05L, 분자량=121.14g/㏖을 대입하면 필요한 용질의 질량은 6.06g이다.

 

2) <표 1> Buffer 제조 

용액을 희석하더라도 분자의 몰 수, 즉, (용액의 부피)×(몰농도)는 일정하다는 사실을 이용해 각 Buffer를 만드는 데에 필요한 Stock Solution을 계산할 수 있다.

① 기본 TRIS-HCl Buffer

Final Concentration	Stock Solution	Volume
5mM TRIS-HCl(pH7.4)	1M TRIS-HCl(pH7.4)	a1 ㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	b1 ㎖
	dH2O	c1 ㎖
Total volume		500㎖

500㎖×5mM = a1㎖×1000mM   ∴a1=2.50

500㎖×5mM = b1㎖×1000mM   ∴b1=2.50

c1 = 500-a1-b1              ∴c1=495.00

 

② Elution Buffer A

Final Concentration	Stock Solution	Volume
5mM TRIS-HCl(pH7.4)	1M TRIS(pH7.4)	a2㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	b2㎖
10mM NaCl	1.5M NaCl	c2㎖
	dH2O	d2㎖
Total volume		200㎖

200㎖×5mM = a2㎖×1000mM    ∴a2=1.00

200㎖×5mM = b2㎖×1000mM    ∴b2=1.00

200㎖×10mM = c2㎖×1500mM   ∴c2=1.33

d2 = 200-a2-b2-c2                 ∴d2=196.67

 

③ Elution Buffer B

Final Concentration	Stock Solution	Volume
5mM TRIS-HCl(pH7.4)	1M TRIS(pH7.4)	a3㎖
5mM MgSO4	1M MgSO4	b3㎖
1M NaCl	1.5M NaCl	c3㎖
	dH2O	d3㎖
Total volume		50㎖

50㎖×5mM = a3㎖×1000mM     ∴a3=0.25

50㎖×5mM = b3㎖×1000mM     ∴b3=0.25

50㎖×1000mM = c3㎖×1500mM  ∴c3=33.33

d3 = 50-a3-b3-c3                  ∴d3=16.17

 

3) <표 2> Buffer 제조

Elution Buffer A의 농도는 10mM, B의 농도는 1000mM이고, Buffer 제조 <표 1>에서와 같이 용질의 몰 수는 일정하며 각 경우 a+b가 50㎖인 것을 이용해 연립방정식을 풀면 표를 채울 수 있다.

	30mM NaCl	100mM NaCl	150mM NaCl	200mM NaCl
Elution Buffer A	a1㎖	a2㎖	a3㎖	a4㎖
Elution Buffer B	b1㎖	b2㎖	b3㎖	b4㎖
Total Volume	50㎖	50㎖	50㎖	50㎖

① a1㎖×10mM+b1㎖×1000mM=50㎖×30mM a1+b1 = 50 ∴ a1=48.99, b1=1.01	② a2㎖×10mM+b2㎖×1000mM=50㎖×100mM a2+b2 = 50 ∴ a2=45.45, b2=4.55
③ a3㎖×10mM+b3㎖×1000mM=50㎖×150mM a3+b3 = 50 ∴ a3=42.93, b3=7.07	④ a4㎖×10mM+b4㎖×1000mM=50㎖×200mM a4+b4 = 50 ∴ a4=40.40, b4=9.60

 

토의 사항

1. 실험 고찰

buffer란 산이나 염기가 첨가되어도 용액의 pH가 거의 변하지 않는 용액이다. 우리는 우선 염기성인 TRIS가 1M이 되게 우선 적은 양의 물에 용해시킨 후, 짝산인 HCl을 넣어 완충용량이 커지도록 pH를 맞춘 다음 증류수로 buffer의 용량을 맞췄다. buffer가 만들어지는 것은 실험 때 TRIS에 HCl을 점점 많이 첨가할수록(pH 7.4에 가까워질수록) pH의 변화가 점점 줄어드는 것을 통해 알 수 있었다.

 

실험에 필요한 용액들의 농도를 1.5배에서 수백 배 크게 만들어 희석시키는 이유는 첫째로 오차의 크기를 줄이기 위해서이고, 두 번째로는 매번 적은 양의 용질의 질량을 재는 수고를 덜기 위해서이다.

 

pH미터의 유리전극은 충격에 약하고 예민하기 때문에 닦을 때나 측정 시에 조심히 다뤄야 하며, 교반기와 동시에 쓸 때에는 마그네틱 바가 닿지 않도록 조심해야 한다. 또한 마이크로피펫을 다룰 때에도 조심히 다루지 않으면 용액이 기기 내로 들어가 고장을 일으킬 수 있으니 유의해야 한다.

 

참고 문헌

1. David W.Oxtoby 외 2명, 옥스토비의 일반화학(6판), 사이플러스, 2008, pp.502~503, p.734