[미생물학실험]획선접종법과 주가평판법에 따른 미생물의 순수배양기술

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

Pure culture is cultivation of a one microorganism. In this experiment, we tested streak plate and pour plate to take a colony. Streak plate was using by loop. The method of pour plate is dilute microorganism and spread in a sollid media. These plates were cultured in 37℃ for 16-18 hour. So, we could gain a colony and count microorganism total count per millilitre.

2. 실험 배경

미생물 실험에서 가장 중요한 것은 실험대상인 균이 다른 균들에 의해 오염되거나 서로 섞이지 않도록 유지, 보관하는 것이다. 그러나 균은 눈에 보이지 않기 때문에 종종 오염될 수 있는데 이럴 때 원하는 균을 순수하게 분리해내는 방법이 바로 순수배양기법이다. 세균의 분리는 고체 생장 배지에서 이루어지며 그 결과 얻어진 집락들은 특정한 성질들을 나타낸다. 

본 실험에서는 획선접종법과 주가평판법을 사용하여 세균의 혼합물로부터 순수배양을 얻어 내고자 한다. 획선접종법은 평판을 가로질러 접종이로 연속된 선을 그음으로써 접종이에 붙어있는 세균의 수를 줄여 단일 집락이 형성되게 하는 방법이다. 우리는 사분면 획선접종법을 통해 세균을 분리, 배양 하였다. 이 방법을 실시하면 도말 최초의 부분은 많은 수의 미생물에 의해서 연결된 집락을 형성하나 도말한 끝으로 갈수록 독립된 집락이 나타난다. 

주가평판법은 용액내의 세균수 측정 및 세균의 순수분리에 이용되는 법이다. 미생물의 밀도가 높은 시료를 단계적으로 희석하여 일정량을 평판배지의 표면에 도포하여 배양하는 방법이다. 혼합균체를 액상한천배지로 희석한 후 페트리접시에 주입하여 단일 콜로니를 골라내며, 이때 사용하는 균체 또는 균체 현탁액의 세균의 숫자를 정확히 알지 못하므로 몇 차례 희석 후 페트리접시에 주입하면 하나의 평판배지에 구분 가능한 수만큼의 콜로니를 형성할 수 있기 때문에 단계적인 희석이 필요하다.

순수배양기법의 조작은 클린벤치와 Spreader, 피펫 등 필요한 기구와 손을 완전히 살균한 다음 시작한다. 균을 취할 때 사용하는 백금이 또한 화염멸균을 통해 완벽히 멸균한 후 사용해야 한다. 이렇게 미생물을 배양한 페트리 접시는 응축수의 낙하와 잡균의 오염을 막기 위하여 거꾸로 뒤집어 배양기 (Incubator) 내에서 1-3일간 배양한다. 

배양기는 여러 미생물의 배양실험에 필요하며 내부를 히터로 가열하며 온도를 자동 온도조절기로 조절하여 일정하게 유지한다. 액체 배양을 살펴보면, 크게 정치배양, 진탕배양, Jar fermentor에 의한 통기교반배양이 있다. 이 배양법들은 배양액 중에 통기를 할 필요가 있을 경우, 균체를 대량으로 얻고자 하는 경우, 균의 검경 등에 사용되는 액체 배양 방법이다.

본 실험에 사용된 균은 Escherichia coli 로 대장균이라고 하며, 대표적인 장내 세균이다. 생화학, 유전공학을 비롯하여 많은 미생물분야의 연구재료로 사용되고 있다. 식품위생에서는 음식물의 하수나 분변의 오염의 지표로 삼는다. 물, 식품, 토양 등에 널리 있으며 일상식품에서도 흔히 검출되는 부패세균의 하나이다. 식품의 부패작용은 Proteus 속 균에 비하면 약하나 decarboxylase의 활성이 있는 균주가 상당히 있어서 알레르기성 식중독과 관련이 있다. 실험에 사용할 세균의 고율 분리와 배양에는 그 세균의 생육 환경을 고려하여 가장 적당한 분리 및 배양조건을 선택하는 것이 필요하다. 

따라서 목적으로 하는 세균 또는 세균군이 어떠한 성질을 갖고 있는가를 잘 생각한 다음 분리 및 배양조건을 결정하여 실험하여야 한다. 또한 미생물 실험 시에는 항상 오염과 멸균 등을 주의하여야 하지만, 특히 대장균과 같은 병원 미생물을 취급할 때에는 멸균과 소독에 각별히 더 주의해야 하며, 실험 도중에도 가능한 자주 손을 씻는 것이 좋다. 

미생물은 최적의 영양물질을 함유하고, 최적의 환경조건 (온도, pH, 호기성, 또는 혐기성 등)하에서 생장 증식한다. 그러나 같은 종류의 미생물이 같은 장소에서 생육하고 있는 것은 드물기 때문에 이것만을 순수 분리하여야 하고, 이 집락의 특성들을 세균의 동정에 사용할 수 있다. 본 실험의 목적은 이와 같이 미생물학의 중대한 기여와 발전에 밑바탕이 된 순수배양기법에 대해 알아보고, 그 방법을 익히는 데에 있다.

 

실험 기구 및 시약

 

1. 획선접종법 (Streak plate)

1) 백금이, 알코올램프, Agar배지, 균주

 

2. 주가평판법 (Pour plate)

1) Spreader, 15 ㎖ tube, PBS buffer, 피펫필러

2) 일회용 피펫 2 ㎖, 10 ㎖, Agar 배지, 균주

 

실험 방법

1. 획선접종법 (Streak plate)

1) 백금이를 화염멸균 후 식히고, 준비된 균을 취하였다. 

2) 고체 배지에 사분면 획선접종법으로 streaking을 하였다. 

3) 반복되는 streaking 각 단계 마다 백금이를 화염멸균 하여 사용했다. 

4) Streaking이 완료된 후, 37℃의 배양기에서 약 16-18시간 배양하였다.

 

2. 주가평판법 (Pour plate)

1) 먼저 총 6개의 시험관을 준비하여 각각 9 ㎖의 PBS buffer을 채워 넣었다. 

2) 배양할 균주 1 ㎖을 취하여 9 ㎖의 PBS buffer가 채워져 있는 첫 번째 시험관에 넣어 희석 시켰다. 

3) 희석액의 1 ㎖을 취하여 9 ㎖의 PBS buffer가 채워져 있는 두 번째 시험관에 넣어 희석 시켜주었다. 

4) 이와 같은 방식으로 10-6까지 희석한 후, 이렇게 10-6까지 희석된 샘플 20 ㎕을 Agar plate에 떨어뜨리고, Spreader를 이용하여 샘플이 배지에 잘 흡수 될 때까지 고루 펴 주었다. 

5) 배양된 plate는 37℃의 배양기에서 약 16-18시간 배양하여 집락수가 25~250개 사이인 평판의 균수를 측정 한 후, BAM (Bacteriological Analytical Manual) 계산법을 이용하여 표준평판계수를 얻어냈다.

C = total 세균 수 n1 = 첫 번째 희석한 plate 수	n2 = 두 번째 희석한 plate 수 d = 첫 번째 희석 배수
※ 단위 CFU/㎖ (Colony Forming Unit)

 

실험 결과

1. 획선접종법

Fig. 1. Process of streak plate

Fig. 2. Result of streak plate

 

Fig. 1은 백금이를 이용하여 세균을 취한 후, 고체 배지에 획선접종법을 수행하는 과정이다. Fig. 2는 획선접종한 균을 배양기에서 37℃에서 16시간 배양시킨 결과이다. Fig. 2는 사분면 획선접종법을 사용한 결과로써, 순차적으로 균의 콜로니의 수가 줄어들면서, 단일 콜로니가 비교적 잘 분리된 것으로 보인다.

 

2. 주가평판법

Fig. 3. Process of pour plate

 

 

Fig. 4. Result of pour plate

Fig. 3은 spreader을 이용한 주가평판법의 과정이다. Fig. 4는 각 단계의 희석액을 20 ㎕씩 취해 spreading 한 것이다. 10-1부터 차례로 10-6까지 보면, 10-6으로 갈수록 희석 배수가 커서 콜로니의 수가 줄어드는 것을 볼 수 있다. 10-2와 10-3 그리고, 10-6의 결과를 보면 그 차이를 한눈에 알 수 있다. 10-1과 10-2은 집락수가 너무 많아 TNTC (Too Numerous To Count) 판정을 하였다. 표준평판계수의 식을 살펴보면 다음과 같다.

 

50은 ㎖의 단위를 맞춰주기 위해 곱해 주었다. 그 결과 값은 1.33×107 CFU/㎖으로 나왔다. 즉, 1 ㎖ 당 1.33×107 개의 균이 들어 있다는 결과가 나왔다.

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험의 순수배양기술에 이용된 획선접종법과 주가평판법은 위의 사진으로 보다시피 성공적인 결과를 나타내었다. 배지에 균을 streaking할 때는 배지 면에 상처가 나지 않도록 적당한 강도로 접종해야 하며, Spreading 또한 배지에 상처가 나지 않도록 꼼꼼히 문질러 주어야 한다. 또한 각 단계마다 다른 미생물에 오염되지 않도록 각별히 주의했고, 백금이의 멸균, 실험대의 청결 등의 실험 시 준수사항을 잘 지켰기 때문에 이러한 만족스러운 결과를 가져올 수 있었다고 본다. 

화염 멸균한 백금이를 사용할 때, 백금이를 식히지 않고 그대로 균을 fishing하면, 균은 protein으로 되어 있으므로 열에 의해 응고되어 죽게 되므로 백금이는 충분히 식힌 다음 사용해야 한다. 균을 배양할 때에도 공중 낙하균의 방지와 응축수가 떨어지는 것을 방지하기 위해 거꾸로 뒤집어 배양해야 한다. 사소하지만 아주 중요한 이와 같은 조작들을 잘 숙지하고 실험을 수행하여야 성공적이며 확실한 미생물 실험을 수행할 수 있다.

 

2. 결론

집식 배양된 배양액은 아직 순수하지 못하며 각종 잡균이 함께 존재하므로 목적 균을 얻으려면 순수분리법의 조작을 반복해야 한다. 순수 배양된 균이여야만 미생물의 형태나 기능에 대한 올바른 지식을 얻을 수 있기 때문이다. 이중 본 실험에서 사용한 방법은 획선접종법과 주가평판법이다. 실험대상인 균을 단일 콜로니로 분리해 내기 위해서 다른 균들에 의해 오염되거나 서로 섞이지 않도록 유지, 보관, 멸균하는 것이 중요하다.

 

참고 문헌

1. 유민, 김병오, 이혜영. 미생물 실험서. 보문각. p. 25 (2012)

2. 오계헌, 강형일, 소재성, 송홍규, 이병욱. 최신 미생물실험. 신광문화사. p. 70 (2010)

3. 고하영, 이준우. 이론 식품미생물학. 광문각. pp. 223-228 (2005)

4. 서승교, 이웅수. 미생물실험법. 동문각. pp. 7-9, 55-57, 68-69 (2005)

5. 미생물학 실험교재 편찬위원회. 미생물학 실험. 월드 사이언스. pp. 27-28, 30-31 (2000)

6. 유주현, 변유량. 식품 미생물학. 효일. pp. 224-225 (2007)

7. 김영지, 김왕준, 남진식, 배지헌, 손규목, 정승원, 조갑연, 조덕봉, 조석금, 채기수. 식품미생물학. 지구문화사. p. 19 (2007)