[유전공학실험]PCR과 Transformation 1부

실험 목적

유전자를 cloning하여 vector에 주입하고, 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다.

실험 이론 및 원리

1. DNA

Deoxyribonucleic acid를 줄인 말로, ‘디옥시리보핵산’이라 부르기도 한다. DNA는 유전물질(genetic material)을 담고 있는 세포의 핵 속에서 발견되는 두 종류의 핵산(nucleic acid) 중 하나로서 핵산을 구성하는 기본 구조인 리보오스(ribose)의2번 탄소에서 산소원자 하나가 제거된(deoxy-) 형태의 핵산을 의미한다. 핵산의 나머지 한 종류는 리보오스의2번 탄소에 산소원자가 그대로 존재하는 형태인 RNA (ribonucleic acid)이다. 생명체의 종류에 따라 예외가 있으나 보통 DNA는 유전정보를 보관 및 보존하는 데 이용되며, RNA는 유전정보를 발현하여 단백질을 만드는 과정 등에서 이용된다. DNA는 거의 모든 생물체의 유전물질로 사용되나, 일부 바이러스는 유전물질로 RNA를 대신 사용한다.

 

 

DNA는 두 뉴클레오타이드 선형 중합체 사슬이 서로 반대 방향으로 뻗어 나가면서 공통의 축 둘레를 오른쪽으로 감으면서 이중나선 구조를 형성한다. 이 이중나선에서 염기는 나선의 안쪽에 있고, 인산과 디옥시리보오스는 바깥쪽에 있다. 염기들은 평면상에서 염기 쌍을 형성할 수 있는데A는T와, G는C와 각각 염기 쌍을 만든다. A-T 염기 쌍은 두 개의 수소결합으로, G-C 염기 쌍은 세 개의 수소결합으로 결합해 있다. ‘

 

2. PCR

PCR은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용해서 많은 양의 DNA를 얻을 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.

 

PCR에 필요한 재료는 다음과 같다. Template DNA, primer(F/R), dNTP(dATP, dTTP, dGTP, dCTP), Taq polymerase. 먼저 Template DNA는 증폭 대상이 되는 DNA이며, primer는 증폭할 부분을 지정해주는 oligonucleotide로 증폭할 부분의 처음과 끝 부분 서열과 상보적으로 이루어져 있다. dNTP는 새로 합성될 DNA의 재료가 되는 nucleotide이고, Taq polymerase는 DNA polymerase 중 고온에 강한 것이다.

 

PCR의 단계는 크게 3단계로 나누어지는데, 각각 denaturation(DNA의 변성), annealing(Primer의 결합), extension(DNA의 합성) 과정이다. 먼저 denaturation은 변성이라고도 하며, 90~96℃로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시키는 과정이다. 이 과정은 생물체 내에서는 helicase가 행하는 부분으로, PCR에서는 인공적으로 합성을 하는 것이므로 denaturation 과정을 반드시 거쳐야 한다. 높은 온도일수록 분리가 잘 되지만 온도가 아주 높은 상태에서는 Taq polymerase의 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃ 정도로 설정한다. 맨 처음 cycle에서는 ssDNA로 보다 잘 변하게 하기 위해 약 5분 정도의 시간을 주며, 이후에는 보통 1분 정도를 준다.

 

다음으로 annealing은 각각 두 가닥으로 분리된 DNA molecule에 primer가 붙는 과정이다. primer는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 정확도를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는가는 primer의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 primer가 DNA molecule에 잘 달라붙지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 primer가 mismatch할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다. 일반적으로 온도는 아래의 식에서 결정되며, 여기서 trial & error 과정을 포함하여 좀 더 구체적으로 결정한다.

 

Tm = (4[G+C])+(2[A+T])℃

여기서 G+C의 계수가 더 큰 이유는 그들이 A+T의 수소결합보다 센 수소결합을 하기 때문이다.

 

마지막으로 extension은 ssDNA에 붙은 primer로부터 DNA 가닥이 신장되는 과정이다. 이 때 Taq polymerase가 작용하며, template DNA와의 상보적인 결합으로 DNA 가닥이 신장된다. 보통 72℃ 내외에서 행하는 경우가 일반적이며, 이때의 온도가 바로 Taq polymerase의 활성이 최대가 되는 온도이다. 시간은 약 2분 간 주어지며, 마지막 cycle에서는 DNA가 충분히 신장될 때까지 기다리기 위해 7분가량으로 더 긴 시간을 준다.

 

PCR cycle 과정 graph

PCR Cycle 중 일어나는 과정 모식도

 

3. Transformation (형질 전환)

수용자 세포(recipient cell)가 외부 유전물질을 받아들여 병합함으로써 그 유전정보를 발현하는 유전자의 변환이 일어나는 현상, 즉 형질 전환을 일컫는다. '형질전환(Transformation)'이라는 용어는 새로운 유전물질을 비세균성 세포인 동물이나 식물세포로 삽입시킬 때도 사용하는 경우가 있다. 의학이나 생물학에서 동물세포의 형질전환이라고 할 때 종종 정상 세포가 암화되는 과정을 지칭하는 경우가 있기 때문에, 동물세포에 대한 형질전환은 형질주입(transfection)이라고 부른다.

1) 형질 전환 조건

한 박테리아에서 다른 박테리아로의 DNA 이동을 위한 형질전환이 일어나기 위해서는 수용자 박테리아는 일시적으로 수용 가능한 상태(a state of competence)로 존재해야 하는데 자연계에서는 기아(starvation)나 세포 밀도(cell density)와 같은 환경적 변화로 인해 유도될 수 있고, 혹은 실험실에서 인위적으로 만들 수도 있다.

 

2) 형질 전환 방법

① 화학적 형질전환

2014년도에 80여종의 박테리아가 형질전환이 가능하며 그람 양성균과 음성균에서 동일하게 형질전환이 일어나는 것으로 보고되었다. 대장균과 같은 그람 음성균의 형질전환에 널리 사용되는 방법은 염화칼슘(CaCl2)처리법이다. 2가 양이온은 세포막의 유동성을 높여주고, 세포 표면의 인지질, lipopolysaccharide(LPS)의 음전하를 중화시켜, 음전하를 띈 DNA의 세포 표면 결합 및 통과를 촉진시키는 것으로 알려졌다. 형질전환시에 염화칼슘으로 처리한 세포에 열충격을 주는데, 이는 세포 구멍이나 손상된 세포벽을 통한 DNA의 세포내로의 이동을 촉진하는 효과가 있다.

② 전기적 형질전환

전기적 형질 전환, 즉 전기천공법(Electroporation)도 있다.세포에 10-20 kv/㎝의 일시적인 전기충격을 가해 세포막을 불안정하게 하고 순간적인 구멍이 형성되어 이를 통해 DNA가 들어가도록 하는 방법이다. 일반적으로 화학적 방법보다 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있다. 이때 DNA 전달량을 유지하기 위하여 비이온성의 보존제를 첨가한다.

③ 자연적 형질전환

자연적 형질전환은 수많은 박테리아 유전자의 발현에 의존적인, DNA 전달을 위한 일종의 세균의 적응 현상이다. 박테리아가 외부의 DNA를 재조합시켜 염색체로 통합시키기 위해 수용 가능한 상태(competent)로 되어야 한다. 자연적인 형질전환은 원핵생물에서 관찰된다. 자연적 형질전환은 전형적으로 세균 성장 곡선에서 정체기에 들어갈 때 세포 밀도가 높거나 영양 결핍 상황에서 주로 일어난다. 테리아가 서식하는 곳에서 박테리아가 죽고 용해되었을 때, 박테리아의 염색체는DNA 조각으로 나뉘어지고 주변 환경에 노출된다. 이 절편들은 유사한 종의 박테리아에 의해 포획되고, 해당 박테리아는 외부 DNA 절편을 염색체에 병합함으로써 형질전환된다.

 

3) 형질 전환의 발견 및 의의

① 형질전환의 발견

그리피스는 당시, 세계1차대전 이후 스페인에서 일어난 대규모 폐렴 감염 사태의 원인인 폐렴균(Streptococcus pneumoniae)에 대한 백신 개발을 목표로 연구를 진행하고 있었다. 당시에는 폐렴균의 조류가 제1형, 제2형, 제3형이 있는 것이 발견되었고 이들의 형질은 고정되어 있는 것으로 알려져 있었다. 그러나 그리피스가 병을 일으키는 제3형-S 균주와 병을 일으키지 않는 제2형-R 균주를 배양하여 비교 실험을 진행한 결과, 살아있는 병원성 S 균주를 생쥐에 주사하면 폐렴으로 죽고 열을 가하여 활성이 없어진 S 균주를 생쥐에 주사했을 때는, 비병원성인 R 균주를 주사했을 때와 같이 아무런 영향이 없었다는 예상대로의 실험 결과와는 다르게 열처리한 S 균주를 살아있는R 균주와 섞은 것을 주사했을 때 생쥐가 죽는다는 실험 결과를 얻었다. 그리피스는 실험한 생쥐의 혈액을 채취하여 배양한 결과 살아있는 S 균주를 발견할 수 있었다. 이러한 실험들을 근거로, 그리피스는 R 균주가 S 균주의 형질전환 물질을 받아들여 S균주로 변환하였고 이 때문에 실험쥐들이 죽은 것으로 결론을 내렸다. 또한 이러한 병원성이 유전되어 전달된다는 사실을 발견하였다.

그리피스의 실험 중 투여한 균의 종류에 따른 실험 결과

② 형질전환의 발견의 의미

그리피스의 이러한 실험은 S균주의 어떠한 화학적 물질로 인해 R균주가 S균주로 변환하였는지 명명하지 못했지만 1944년 에이버리가 이 물질이 DNA라고 명명했다. 열처리는 균주를 죽일 수 있었지만 DNA는 비교적 안정적으로 남아있을 수 있었고, 살아있는 R 균주는 이를 취하여 스스로 S균주로 전환할 수 있었다는 것이다. 이때 S균주로부터 얻은 DNA에는 콜로니를 매끄럽게 보이게 하는 겉껍질을 만드는 데에 필요한 유전자들이 코드 되어 있었고, R균주는 이들을 성공적으로 발현시켜서 숙주로부터 자신을 보호하여 주입된 생쥐에게 폐렴을 일으킬 수 있었다.

 

그 후 1952년, 허쉬와 체이스가 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지의 단백질과 DNA를 동위원소를 이용하여 서로 구분되게 표식한 후, 박테리아를 감염시켜 형질 전환을 일으키게 하는 물질이 DNA임을 명확히 보이는 실험을 진행하게 된다. 이에 따라 DNA가 유전 물질이라는 것이 알려지게 되고 마침내 1953년, 윌킨스와 프랭클린이 DNA의 분자적 구조를 밝히고, 이를 바탕으로 왓슨과 크릭이 DNA가 어떻게 유전 정보를 보유하고 전달할 수 있는지 해석해 냄으로써 분자생물학 역사상 가장 중요한 발견을 완성하게 된다.

4. Competent cell (수용성 세포)

외부의 DNA를 삽입할 수 있도록 처리한, 자신의 유전적 변화를 일으킬 수 있는 상태의 세포를 의미한다. 대부분은 대장균에 유전자를 도입할 때에 사용하는 균체의 뜻으로 사용한다. 자연 상태의 미생물의 경우 형질전환 효율이 낮다. 이를 높은 효율로 외래DNA를 흡수하도록 제작된 세포를competent cell이라고 한다.

1) competent cell의 제작 방법

수용성 세포를 제조하기 위한 방법은 heat shock 또는 electroporation중 선택한 형질전환 방법에 따라 다양하다.

① Heat shock (chemical transformation)

Heat shock의 경우에는 세포막의 투과성을 높이기 위해 염화 칼슘(CaCl2)에서 세포를 배양하여 수용성세포를 만든다. 수용성을 높이기 위해 Ca2+ 외에 망간(Mn2+), 칼륨(K+), 코발트([Co(NH3)6]3+), 루비듐(Rb) 등의 양이온이 대체된 시약을 사용하는데 이러한 시약은 세포막의 유동성을 증가시키고 지질당류에 의한 음전하를 낮춰주는 역할을 한다. 이러한 4℃의 염화 칼슘 용액에서 세포막이 변화를 일으키는데, 형질전환을 위하여 DNA를 넣고 37~40℃사이에서 1분 정도의 열처리를 하면 세포막에 구멍(pore)이 형성되고, DNA가 세포 내부로 들어가게 된다. 

이후 37℃에서 배양한 후 선택 조건(selection)에서 형질전환이 일어난 세균 군집을 얻을 수 있다. 이러한 방식은 대장균 뿐 만 아니라 동물세포에도 적용 가능한데, 동물 세포의 경우에는 염화 칼슘 외에 소량의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하기도 한다. 이렇게 처리된 미생물(competent cell)에 플리스미드 DNA를 섞어주면 플리스미드는 양전하를 띠는 이온과 complex를 형성하고 세포막에 붙는다. 분자량이 큰 DNA가 세포막을 통과하도록 heat shock을 가해주면 세포막이 순간적으로 세포 내외부의 전위차 발생(탈분극으로 인한)으로 음전하를 띤 DNA가 세포 내부로 쉽게 들어간다.

Chemical Transformation

② Electroporation

형질전환의 기본 원리는 화학적 형질전환 방법과 유사하며, 차이점은 heat shock이 아닌 전기 충격을 가해 세포막의 유동성을 증가시켜 플라스미드 DNA가 투과할 수 있도록 한다는 점이다. 그리고 전기 충격의 세기가 커질수록 미생물이 죽을 확률이 높아지고, 세기가 약해질 수록 형질전환의 효율이 감소하게 되므로 적절한 최적 세기를 알아내야 한다. 

아쉽게도 미생물 종마다 세포막의 구성성분이 다르므로 최적의 세기는 시행착오를 통해 알아내야 하는 어려움이 있다. 그러나 화학적 형질전환 방법보다 효율이 높은 장점이 있고, 전기 충격을 가하는 기계가 이미 구비되어 있다면 형질전환을 쉽게 할 수 있기에 실험실에서 많이 활용하고 있는 방법이다.

전기 충격 전	전기 충격 후
전기충격 시 나타나는 세포막의 재배열

 

5. Operon (오페론) & Lac Operon (젖당 오페론)

오페론이란(operon)이란 기능적으로 연관성이 큰 일련의 단백질의 발현을 조절하는, 밀집된 유전자 발현 시스템을 의미한다. 발현은 하나의 프로모터(promoter)에 의해 조절된다. 오페론은, 여러 개의 유전자가 존재하는 다중시스트론성(polycistronic) 전령RNA(mRNA)를 만든 다음, 순차적으로 각각 독립된 단백질을 발현하도록 한다. 

 

대부분의 오페론은 2~6개의 유전자를 포함하지만 많게는 20개 이상을 갖기도 한다.

Lac operon(젖당 오페론)은 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase)와 갈락토사이드 투과효소, 싸이오갈락토사이드 트랜스아세틸레이스(thiogalactoside transacetylase)의 발현을 조절한다.

Lactose가 없을 때, 유전자 앞쪽에 있는 inhibitor가 RNA polymerase의 활동을 방해하여 β-galactosidase가 생성되지 않도록 한다. 반면Lactose가 있을 때, RNA polymerase가 잘 작동해 mRNA를 만들고, 이는 β-galactosidase를 만들어 lactose를 분해한다. Lactose는allolactose로 변화하고, 이는 다시lac 억제 인자와 결합하여 lac 억제인자는 불활성화된다. 불활성화된 억제인자는 더 이상 작동유전자에 결합하지 못하게 되며 RNA 중합효소에 의한 lac operon의 전사는 증가한다.

 

6. Blue-white screen

Blue-white screen 은 vector에 특정 DNA가 삽입된 재조합 박테리아를 빠르고 쉽게 검출하는 기법이다. Lac Z (β-galactosidase gene)를 갖고 있는 플라스미드에 Lac Z가 들어온다면 β-galactosidase가 활성화된다. 또한 β-galactosidase는 lactose를 glucose와 galactose로 분해하고, lactose의 유사한 구조를 갖고 있는 X-gal를 분해하면서 파란색 colony를 만들게 된다.그러나 Lac Z 갖고 있는 플라스미드의 Lac Z에 다른 유전자가 들어가면 β-galactosidase가 활성되지 않으므로 하얀색 colony를 나타나게 됩니다

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