[일반생물학실험]Xenopus의 발생과 축(axis)의 형성

실험 이론 및 원리

1. 실험 요약

양서류는 배아발생, 유도작용, 세포의 운명결정 및 패턴형성 등에 대한 연구에 많이 이용되어왔다. 이번 실험에서는 Xenopus laevis의 미수정란을 관찰해보았다. Xenopus의 알은 animal pole과 vegetal pole로 확연히 구별되는 생김새를 가진다는 것을 관찰할 수 있었고, 여기서 더 나아가 Xenopus의 발생과정과 축의 형성에 대하여 알아보았다.

 

2. 실험 배경

도롱뇽 및 개구리와 같은 양서류 배아는 알이 크고 발생이 빠르기 때문에 실험발생학의 재료로 선택되었으며, 특히 이식실험에 가장 적합하다. 하지만 전반적으로 양서류 배아는 염색체 수가 많고, 돌연변이 등의 어려움이 있어 발생유전학의 연구에는 부적합하다. 그 중 아프리카 원산 무미 양서류의 일종인 Xenopus laevis는 다른 양서류에 비해 난자를 계절과 무관하게 비교적 쉽게 구할 수 있고, 실험실에서의 성체 사육이 가능하며 발생속도가 빠르고 실험적 조작에 대해서 잘 견딘다는 장점이 있다.

Figure.1. Life cycle of Xenopus laevis

 

Figure.2. 발생단계의 각 stage

대부분의 개구리와 도롱뇽의 배아는 극피동물과 같이 방사대칭형 완전난할을 한다. 하지만 양서류 알은 성게 알에 비해 많은 난황을 가지고 있고, 식물극에 많이 분포한 난황은 난할에 영향을 주게 된다. 첫 번째 분열은 동물극에서 시작하여 식물극으로 천천히 진행된다.

Figure.3. Cleavage of embryo(성계, 개구리, 닭, 초파리)

<Figure.3.>에서 분열홈이 동물반구와 식물반구에서 차이가 나는 것을 알 수 있다. 첫 번째 분열홈이 식물반구의 난황이 많은 세포질에서 계속 진행하고 있는데도 불구하고, 두 번째 분열이 이미 동물극에서 시작하는 것을 볼 수 있다. 첫 번째와 두 번째 난할은 경할로 서로에 대해 수직으로 일어난다. 세 번째 분열은 예정대로 수평으로 일어나지만, 식물극에 위치한 난황 때문에 분열면은 적도면이 아니라 동물극으로 치우친다. 그 결과 개구리 알은 동물극에 네 개의 작은 할구와 식물극에 네 개의 큰 할구로 나누어진다. 이러한 불균등한 완전난할은 빠르게 분열하는 동물극의 소할구 영역과 느리게 분열하는 식물극의 대할구 영역으로 구분한다. 분열이 진행됨에 따라 동물극 부위는 수많은 작은 세포로 채워지고, 반면에 식물극은 상대적으로 적은 수의 크고 난황이 많은 대할구가 차지한다.

Xenopus의 초기 할구 세포주기는 세포질의 유사분열 촉진인자(MPF)의 농도에 의해 조절된다. MPF는 사이클린과 사이클린 의존성 키나제인 cdc2로 구성된다. Xenopus에서 12번째 분열 때까지는 G시기가 없기 때문에 분열 사이에 성장은 일어나지 않는다. 이 기간에는 유사분열에 필요한 최소한의 과정, 즉 DNA 복제 등만 일어난다. 활성화된 MPF는 세포를 자극하여 유사분열을 진행시키며, MPF가 붕괴되는 세포는 S기로 들어간다.

16~64개의 할구를 가진 양서류 배아를 상실배(morula)라 부르고, 128~세포기의 배아를 포배(blastula)라 하며, 투명한 포배강이 존재한다. 실제로 포배강의 형성은 첫 번째 분열홈에 원인이 있다. Xenopus에서 첫 번째 분열홈은 동물반구에서 폭이 넓어진 후 세포 간 밀착결합으로 봉합되면서 조그마한 세포 내 공간을 형성하게 된다. 이 공간은 계속된 난할과저에서 팽창하여 결국 포배강이 된다.

Figure.4. Gastrulation in amphibians

포배는 내배엽기관을 형성할 부위를 안쪽으로 끌어오고, 외배엽을 형성할 세포들은 바깥쪽을 감싸며, 그리고 이들 두 배엽 사이의 적당한 위치에 중배엽성 세포들이 자리를 잡아야 한다. Xenopus에서 중배엽성 전구체세포는 심층에 존재하는 반면, 내외배엽성 전구체세포는 배아의 표면에 있는 세포로부터 유래한다. 척삭과 다른 중배엽성 조직의 전구체는 배아의 적도면과 그 주변 부위의 표면 바로 아래에 존재한다. 동물반구의 표면은 외배엽 세포가 될 것이고, 식물반구의 표면은 소화관과 관련된 조직을 형성하며, 중배엽의 세포들은 적도 부근의 내부 세포질에서 유래할 것이다. 이러한 일반적인 운명지도는 알에서 전사인자인 VegT와 TGF-β의 국소분비인자인 Vg1에 의해 정해진다. 이들의 mRNA는 알에서 식물반구의 피질에 분포하고 있으므로, 난할 중에 식물극 세포에만 할당된다.

개구리 배아의 낭배형성은 배의 장차 등쪽이 될 회색신월활 부위, 즉 적도면 바로 아래(marginal zone)에서 시작된다. 이 부위에 존재하는 잠재적인 내배엽성 세포들은 갈라진 틈새와 같은 원구를 형성하기 위하여 함입된다. 각 세포의 몸체는 배아의 안쪽으로 이동하는 반면에, 세포의 일부는 가는 돌기에 의해 바깥쪽과 연결되어 있다. 그 결과 세포는 홀쭉한 병 모양의 형태가 되는데 이 세포를 bottle cell라 부르며 초기의 원장형성을 유도한다. 다음 단계의 낭배형성과정은 marginal zone 세포들의 회절이 일어나고, 동물세포들이 외적을 하여 원구에 모이게 되고, convergent extension이 일어난다. 

이동하는 marginal zone 세포들은 dorsal lip of blastopore에 도달해서 안쪽을 향하여 바깥 세포층의 내면을 따라 계속 들어간다. 새로운 세포들이 배아의 안쪽으로 함입됨에 따라 포배강은 원구의 dorsal lip의 반대편에 놓이게 된다. 그 동안 원구 주위로 병세포의 형성과 함입이 계속됨에 따라 원구는 측면과 배쪽으로 확대된다. 원구는 식물극에 남아있던 내배엽성 큰 세포들로 둘러싸인 원 모양이 된다. 남아 있는 내배엽의 부분을 yolk plug라 하며 결국은 이것 역시 안으로 들어가게 된다. 이 시점이 되면 모든 내배엽성 세포들은 배의 안쪽으로 들어가며, 남아 있는 바깥쪽 세포들은 외배엽세포가 되고, 중배엽은 그들 사이에 놓여진다.

등-배 축은 정자의 침입장소에서 찾을 수 있다, 정자 중심체의 미세소관은 세포질 운동을이끌어 정자 침입지점의 반대편에 위치한 식물세포에 원구를 유도하는 능력을 부여하게 된다. 그래서 정자 침입지점의 반대편에 원구가 형성되며 몸의 등쪽 부위가 된다.

정자가 침입함에 따라 안쪽 세포질에 대해서 피층 세포질이 회전 이동한다. 안쪽 세포질은 무거운 난황물질의 중력 때문에 원래 위치를 유지하지만, 반면에 바깥쪽 세포질은 본래 위치에서 약 30°가량 활발하게 회전한다. 이렇게 해서 새로운 몸의 축이 만들어진다. 미수정란은 동-식물극 축에 방사대칭이지만, 수정란은 등-배 축을 가지게 되어 좌우대칭이 된다. 이러한 세포질 이동은 정자 침입장소 반대편의 세포질을 활성화시켜 낭배형성을 시작하게 한다. 정자가 침입한 이 부위는 배아의 머리방향이 되고, 그 반대편인 회색 신월환 부위에서 낭배가 시작되어 장차 올챙이의 꼬리쪽이 된다. 동시에 동물 쪽은 배의 등쪽 방향이 되고, 식물반구는 복부로 발생한다.

Figure.5. DP axis와 관련된 여러 구조

Figure.6. Acumulation of β-catenin in a Xenopus embryo

 

양서류의 축 형성은 조절발생의 대표적인 예이다. 스페만은 dorsal lip과 그 유도된 조직들을 가리켜 형성체(organizer)라고 하였다. 이 조직들은 수용자 배쪽 조직의 운명을 바꿔 신경관과 등쪽 중배엽조직(체절)을 형성하도록 하며, 수용자와 공여자 조직을 분명한 앞-뒤 축과 등-배 축을 가진 제 2의 배아로 조직화하기 때문이다. 형성체를 유도할 수 있는 등쪽에 가까운 식물세포들을 Nieuwkoop center라 부른다. Nieuwkoop center는 수정 직후 일어나는 세포질 회전에 의해 생성된다.

β-catenin은 등쪽 축의 형성에 결정적으로 중요하다. β-catenin은 수정 시 세포질이 이동하는 중에 알의 등쪽 부위에 축적되기 시작한다. 초기 난할 중에도 β-catenin은 선택적으로 등쪽에 계속해서 쌓이며, 축적은 등쪽면의 핵에서만 관찰된다. 이러한 β-catenin이 쌓이는 부위는 Nieuwkoop center와 organizer 부위에 해당한다. 난할 후기가 되면 β-catenin을 가진 세포는 특히 Nieuwkoop center에서만 존재한다. 실험적으로 β-catenin을 제거하면 등쪽 구조가 없는 배아가 되며, 배아의 복부쪽에 β-catenin을 주입하면 제 2의 축이 형성된다. β-catenin은 Wnt 신호전달경로의 한 부분으로 GSK-3에 의해 억제된다.

Xenopus에서 앞-뒤 축의 형성은 등-배 축의 형성에 뒤따라 일어난다. 즉 배아의 등쪽 부위가 확립되고 나면, 회절하는 중배엽의 이동으로 앞-뒤 축이 성립된다. 처음으로 등쪽의 dorsal lip에서 이동하는 중배엽은 앞쪽(머리) 구조로 발달하고, 측면과 배쪽 입술에서 이동하는 중배엽은 뒤쪽(꼬리) 구조를 형성하게 된다.

등쪽 중배엽의 형성에는 몇가지 유전자의 활성화가 필요하다. Nieuwkoop center에서 분비된 단백질은 바로 위의 중배엽세포에서 일련의 전사인자의 발현을 활성화시킨다. 이들 전사인자는 다시 organizer에서 분비 단백질의 발현을 촉진시킨다. 형성체에서 분비되는 단백질에는 형성체Ⅰ 확산 단백질(BMP 억제자)인 Noggin, Chordin, Xnr3, Follistatin, BMP4과 형성체Ⅱ의 확산 단백질(Wnt 억제자)에 해당되는 Cerberus, Frzb, Dickkopf 등이 있다.

Figure.7. Primary organizer signals

올챙이는 외관상 좌우대칭이지만 심장과 소화관 같은 몇몇 기관은 좌우로 균등하게 분포하고 있지 않다. 다시 말해, 배아는 좌-우 축을 가지고 있다는 의미이다. 어찌되었던 몸은 좌우에 대한 실마리를 가지고 있음에 틀림없다. 지금까지 연구된 모든 척추동물에서, 좌-우 축 형성에 결정에 중요한 것은 배아의 왼쪽에 위치한 측판 중배엽에서 nodal 유전자가 발현하는 것이다. 이에 해당하는 Xenopus의 유전자는 Xnr1로, 이것을 오른쪽에서 발현하게 만들면 심장의 위치와 창자의 꼬임이 무질서하게 바뀐다.

Xnr1이 왼쪽에서만 발현되는 것은 세포질 회전에 관여하는 미세소관의 형성을 억제하면 좌-우 축은 형성되지 않기 때문이다. 그 다음으로 식물반구 전체에서 발현되는 Vg1 단백질은 배아의 왼쪽에서 우선적으로 활성화된다. Xnr1 단백질에 의해 발현되는 중요 단백질 중 하나는 Pitx2로 배아의 왼쪽 면에서만 발현된다. Pitx2는 심장과 창자가 발달함에 따라 배아의 왼쪽 면에서만 존재하면서 이들 기관의 위치를 조절한다.

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 준비된 Xenopus의 미수정란을 두 개의 group으로 나누어 각각 1 x SOS 용액과 2 x SOS 용액에 넣는다. 

2) 2 x SOS 용액에 있는 미수정란에서 예리한 핀셋(포셉)으로 난황막을 제거한다. 

3) 현미경을 통하여 1 x SOS 용액에 있는 미수정란의 animal pole, vegetal pole 등의 생김새를 관찰한다. 

4) 영상자료를 통해 Xenopus의 알의 난황막을 제거하거나, animal cap을 분리해내는 실험기법 등 세밀한 몇 가지 실험기법을 관찰한다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

Figure.8. 1 x SOS 용액 내의 Xenopus 미수정란

⇒어두운 색의 animal pole과 밝은 색의 vegetal pole를 구별할 수 있다. 알끼리 size가 서로 다른 것을 확인할 수 있다. 다른 알과 달리 색깔이 진한 주황색을 띄는 알은 죽은 알이라고 추측된다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

본 실험에서는 Xenopus의 미수정란을 관찰하였다. 미수정란의 외부 생김새는 animal pole은 고동색, vegetal pole은 연한 노란색을 띄기 때문에 육안으로 확연히 구별할 수 있었다. 이 미수정란을 1 x SOS 용액과 2 x SOS 용액에 넣어두었다가 어느 정도의 시간이 흐른 후에 각각을 관찰하였다. 영상자료에서 Xenopus의 알을 조작하고, 난황막을 제거하고, animal cap을 제거하는 등의 비교적 기초적이지만 실제의 세밀한 조작을 보고 난 후, 직접 난황막을 제거해보았다. 

2 x SOS 용액에 있는 알에서 난황막을 제거했는데, 수집한 알은 따로따로 흩어져있지 않고 뭉쳐있었기 때문에 예리한 포셉으로 알에 손상이 가지 않게 하는 것이 중요했다. 2 x SOS 용액은 1 x SOS 용액보다 2배만큼 농도가 진하기 때문에 삼투의 원리에 의하여 1 x SOS 용액보다 2 x SOS 용액내의 미수정란으로부터 난황막을 제거하기가 더 용이해질 수 있었다. 1 x SOS 용액에 있는 알은 현미경으로 관찰을 해보았고 <Figure.8>과 같이 확인할 수 있었다.

 

참고 문헌

1. Scott F. Gilbert, 발생생물학(8판), 2007, 라이프사이언스, pp.151~178