[생화학실험]아미노산의 적정(Amino Acid Titration)

실험 목적

HCl, NaOH 용액으로 주어진 아미노산 시료들을 적정해 얻어진 적정곡선을 분석하여 정체를 알아내는 것이다.

 

실험 이론 및 원리

1. 서론

아미노산은 약한 다양자성 산이다. 아미노산들은 관여하는 반응에 따라 산 또는 염기로 작용한다. 이는 아미노산의 α-C에 붙어있는 COO-, NH3+기, R group이 pH에 따라 각각 다른 형태로 존재하기 때문이다. 아미노산은 산으로 적정할 때 염기로 작용하고 염기로 적정할 때는 산으로 작용한다.

2. 아미노산(Amino Acid)

1) 구조

단백질에서 볼 수 있는 20종류의 표준 아미노산은 모두 ɑ-아미노산이다. 이들은 모두 같은 탄소원자(ɑ탄소)에 한 개의 카르복실기와 한 개의아미노기가 결합되어 있다.(그림 1). 아미노산은 곁사슬 또는 R기(R group) 의 구조, 크기, 전하 등이 서로 다르며, 이들이 아미노산의 물에 대한 용해도에 영향을 주고 있다. 단백질의 표준 아미노산은 3-문자와 1-문자의 기호로 표기하는데 3-문자 부호는 일반적으로 각 아미노산의 이 름의 3글자 약어로 구성되므로 명확하다. 1-문자 부호는 아미노산 서열을 기술하는 정보파일(구멍 뚫린 카드 사용)의 크기를 줄이기 위한 의도가 반영된 것이다.(표 1)

그림 1 아미노산의 일반 구조.

  

이 구조는 단백질의 모든 아미노산에 공통된 것이다. (고리형 아미노산인 프롤린은 제외함). ɑ-탄소에 붙은 R기 또는 곁사슬은 각 아미노산에 따라 다르다.

표 1 표준 아미노산의 약자

 

2) 분류

아미노산은 R기의 성질 특히 극성(polarity)또는 생물학적 pH(pH7.0정도)에서 물과 상호 작용하는 경향에 따라서 주요 다섯 가지 종류로 분류할 수 있다. 20종류의 표준 아미노산의 구조는 그림 2와 같으며, 아미노산은 각 종류에서도 R기의 극성, 크기, 형태 등에 따라 조금씩 다르다.

 

그림 2 단백질을 구성하는 20종류의 표준 아미노산.

그림은 pH7.0에서의 상태, 즉 아미노기와 카르복실기가 이온화된 상태로 표시 되었다.

① 비극성, 지방족R기 이 종류의 아미노산에 속하는 R기는 비극성이고 소수성이다. 알라닌, 발린, 류신, 이소류신의 곁사슬은 단백질 내부에서 뭉치(cluster)를 형성하는 경향이 있으며, 소수성 상호작용을 하여 단백질 구조를 안정화시킨다. 글라이신은 가장 간단한 아미노산의 구조를 하고 있다. 이 아미노산은 분류상 비극성이긴 하지 만 매우 작은 곁사슬을 가지기 때문에 소수성 상호작용에 있어 직접적인 영향을 미 치지 못한다. 황을 포함하는 두 종류 아미노산 중의 하나인 메싸이오닌은 곁사슬에 하나의 비극성 싸이오에터(thioether)기를 가지고 있다. 프롤린의 지방족 곁사슬은 특이한 고리형 구조를 가지고 있다. 프롤린 잔기의 2차 아미노기는 프롤린을 함유하고 있는 폴리펩타이드 부위의 구조적 유연성을 감소시키는 단단한 입체 형태로 묶여져 있다.

② 방향족R기 페닐알라닌, 타이로신, 그리고 트립토판은 방향족 곁사슬을 가지고 있으 며 상대적으로는 비극성(소수성)이다. 이들은 모두 소수성 상호작용에 관여할 가능성이 있다. 타이로신의 하이드록실기는 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 어떤 효소의 활성에 중요한 작용기로서 작용한다. 타이로신과 트립토판은 페닐알라닌보다 상당히 극성이 높은데, 이것은 타이로신의 하이드록실기와 트립토판이 인돌 고리의 질소원자 때문이다.

③ 극성, 비전하 R기 이들의 아미노산의 R기는 물과 수소결합을 하는 작용기를 가지고 있으므로, 비극성 아미노산의 R기보다 친수성이고 물에 녹기 쉽다. 이 종류의 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라진과 글루타민이 포함된다. 세린과 트레오닌의 극성은 그의 하이드록실기에 의한 것이며, 시스테인(cysteine)의 극성은 설프하이드릴기(-SH)에 의한 것이고, 아스파라진과 글루타민의 극성은 아마이드기 (amide) 때문이다.

④ 양전하(염기성) R기 대부분의 친수성 R기는 양전하를 띠거나 음전하를 띤다. pH7.0 에서 R기가 상당한 양저하를 띠는 아미노산에는 그 지방족 사슬의 ɛ 위치에 제2의 아미노기를 가지고 있는 라이신, 양전하를 띠는 구아니디노기(guanidino group)를 가진 아지닌, 그리고 이미다졸기(imidazole group)를 가지고 있는 히스티딘이 있다. 히스티딘은 거의 중성의 pKa에서 이온화할 수 있는 곁사슬을 가지고 있는 유일한 아미노산이다. 많은 효소촉매 반응에서 히스티딘 잔기는 양성자 주개나 받개로 작용 함으로써 반응을 촉진한다.

⑤ 음전하(산성) R기 pH7.0에서 R기가 전체적으로 음전하를 가지고 있는 2가지 아미 노산은 아스파트산과 글루탐산이고, 이들은 각각 제2의 카르복실기를 가지고 있다.

3. pH meter

1) 원리

pH측정은 측정전극(Glass Electrogen)과 기준전극(Reference Electrode)의 직접 전위차법을 이용하여 용액중의 수소이온농도를 분석하는 장치이다. 물질과 전기와의 관 계를 이용하여 그 물질을 분석하는 전기화학 분석법의 하나인 전위차법의 원리는 전극에 접하고 있는 물질을 (농도에 따라 전극전위가 달라지기 때문에) 시료용액에 적당한 전극을 담그고 그 전극전위를 측정하면 원하는 화학종을 정량할 수 있다.

측정전극인 수소이온 선택성 지시전극인 유리전극과 은(Ag),염화은(AgCl) 기준전극을 시료용액에 담그고 두 전극 사이의 전위차를 측정하여 pH를 측정하는 장치인데 pH값을 정확하게 읽을 수 있도록 전위차에 해당하는 pH척도가 그려져 있다.

수소이온 선택성 유리전극은 막전극 중에 가장 널리 알려져 있는 것으로 중요한 부분 은 밑바닥에 붙어있는 대단히 얇은 유리막이다. 이 속에는 일정농도의 표준 염산액이 채워져 있고 은-염화은 전극이 꽂혀 있는데 이것은 일정한 전위를 가지는 기준전극의 역할을 한다. 중성용액에서는 유리막 내면에 농축된 상태로 존재하는 수소이온이 유리막의 안쪽 표면에 결합하면 유리막은 전기적으로 중성을 유지하여야 하기 때문에 유리막 바깥쪽 표면에 결합하고 있던 수소이온이 같은 숫자만큼 유리 막으로부터 유리된다. 유리전극을 NaOH와 같은 알칼리성 용액에 담그면 유리전극의 바깥쪽은 수소 이온의 활성도가 대단히 낮아서 유리 막의 바깥표면에 결합되어 있던 수소이온이 용액 중의 수산화이온(OH-)과 반응하여 물을 만든다. 

이렇게 되면 유리전극의 안쪽에서는 HCl로부터 수소이온이 해리되어 유리 막이 전기적으로 중성을 유지할 때까지 유리 막 안쪽에 결합하게 된다. 즉 유리전극의 바깥쪽은 Na+와 같은 양이온의 농도가 높아지게 된다. 반대로 유리전극을 산성용액에 담그면 전극의 바깥쪽은 수소이온의 활성도가 대단히 높아서 유리 막 바깥 표면의 빈자리를 수소이온이 차지하게 된다. 이렇게 되면 유리 막 안쪽 표면에 결합되어 있던 수소이온이 유리막이 전기적으로 중성을 유지할 때까지 유리 막으로부터 유리되고 이들은 유리전극 내부에 존재하는 염소이온과 결합 한다. 그러므로 유리전극의 안쪽에서는 염소이온의 농도가 낮아지게 되고, 바깥쪽에서는 수소이온의 농도가 낮아지게 된다. 이와 같은 유리전극의 안과 밖의 전하 차이가 전위차의 원인이 된다.

 

2) 조작방법

① 유리전극을 미리 물에 수 시간 이상 담가 둔다.

② pH미터는 전원을 넣어 5분 이상 경과 후에 쓴다.

③ 검출부는 물로 잘 씻고 부착한 물은 휴지 등으로 가볍게 닦아낸다.

④ 온도보상용 꼭지가 있는 것은 pH 표준액의 온도와 같게 맞추고 검출부를 시료의 pH값에 가까운 표준액에 담가 2분 이상 된 후 pH미터의 지시가 온도에 있어서의 pH값이 되도록 영점조절용 곡지를 조절한다.

⑤ 두 점에서 조절을 한 경우에는 보통 인산염 pH표준액과 검출액의 pH값에 가까운 pH표준액을 써서 조작한다.

⑥ 검출부를 물로 잘 씻고 부착한 물을 여지 등으로 가볍게 닦아 낸 다음 검출액에 담 가 측정값을 읽는다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) 0.1M 히스티딘, 알라닌, 글루탐산 각각 200㎖씩(시약병 표면에는 아미노산 이름을 적지 말고 미지시료 A, B, C로 표기)

2) pH 미터기 많을수록 좋음(조별로 있으면 가장 좋지만 최대한 많이 확보해야 실험이 빨리 끝남)

3) 표준 완충용액, 0.1M NaOH, 0.1M HCl

4) vortexer, 50㎖ 뷰렛 8개와 스탠드 4개 set (스탠드 하나당 두 개씩 – HCl, NaOH용)

5) 작은 비이커 50㎖ 2개 (HCl, NaOH 뷰렛에 부을 때 사용)

6) 비이커 250㎖ 16개 (조당 HCl, NaOH 중 한가지 적정만 선택해서 하면 8개로 가능)

7) 폐액통, Kim wipes, 증류수

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 시료 준비

Group A : 아미노산 A, 0.1M KH2PO4과 0.1M K2HPO4를 1:1로 혼합한 용액

Group B : 아미노산 A, 아미노산 B

Group C : 아미노산 B, 아미노산 C

Group D : 아미노산 C, 0.1M KH2PO4과 0.1M K2HPO4를 1:1로 혼합한 용액

각각 25㎖씩 250㎖용 비이커에 넣고 증류수 50㎖를 첨가한 시료를 두 개씩 준비(조당 HCl, NaOH 중 한가지 적정만 선택해서 하면 1개만 준비)

 

2) 시료가 들어있는 비이커 하나에 0.1M HCl or NaOH을 1㎖ 씩 첨가하면서 pH 변화를 측정

① pH 미터기 표준화

② 시료의 pH 측정

③ 뷰렛에 담긴 HCl (혹은 NaOH) 용액을 1㎖ 첨가

④ 잘 혼합

⑤ 시료의 pH 측정

⑥ 계속해서 1㎖ 씩 HCl or NaOH을 첨가해 가면 pH 1.5(HCl) / pH 12(NaOH)근처에 이를 때까지 pH 측정

 

3) HCl 적정한 후 pH 변화와 NaOH로 적정한 후 pH 변화를 한 그래프에 나타내고 사용한 시료가 어떤 아미노산 이었는지를 측정

※ pH 미터기가 적으면 조를 나눠 NaOH나 HCl 한가지로만 적정을 해야 할 것 같음

주의 사항

1. pH미터를 닦을 땐 전극을 휴지로 가볍게 털어내듯이 닦는다. 이때 휴지나 종이로 전극을 문지르지 않는다.

2. pH미터의 구조 및 조작법의 상세한 것은 pH미터에 따라 다르므로 각각의 pH미터에 따 른 조작법에 따라 사용하도록 한다.

3. pH11이상의 시료는 오차가 크므로 알칼리에서 오차가 적은 특수 전극을 쓰고 필요한 보 정을 한다.

4. 시료의 온도는 pH표준액의 온도와 동일한 것이 좋다.

 

실험 결과

1. 결과 분석

아미노산 A

아미노산 B

아미노산 C

인산 혼합 용액

 

토의 사항

1. 실험 고찰

아미노산은 알칼리를 첨가하면 수소이온을 잃고, 산을 첨가하면 수소이온을 가진다. 그 때문에 아미노산의 수용액은 pH의 변화에 저항하는 완충작용을 가진다. 히스티딘, 알라닌, 글루탐산은 각각 필수아미노산의 한 종류로 성질이 다르다. 염기성인 히스티딘, 산성인 글루탐산, 비극성이며 중성인 알라닌으로 나뉜다.

 

아미노산은 가운데 탄소를 중심으로 -H, 카르복실기, 아미노기, 아미노산을 결정하는 작용기가 이렇게 4개가 달려있는데 이때, 수소를 제외한 나머지 부분은 용액의 pH 에 따라서 전하량이 변하게 된다. 이 전하량을 단순히 계산한 식이 net charge 이다. net charge는 pH에 따라 크게 변하고 net charge가 0이 되는 pH를 등전점이라고 한다.

 

아미노산의 카르복실기과 아미노기의 일반적인 구조는 중성 pH를 나타낸다. 하전된 작용기가 없는 아미노산은 전하가 없는 zwitter 이온과 같은 중성 용액에 존재한다. Zwitter이온은 같은 양의 음전하와 양전하를 갖기 때문에 용액 상태에서 전기적으로 중성이다.

아미노산을 적정할 때, 그것의 적정 곡선은 H+과 각 작용기의 반응을 나타낸다. 알라닌의 카르복실기와 아미노기는 적정 곡선을 형성할 수 있는 두 개의 작용기이다. 아주 낮은 pH 상태의 알라닌은 양성자를 가지고 있는 카르복실기와 양전하로 하전되어 양성자를 갖는 아미노기를 포함하고 있다. 이러한 상태에서의 알라닌의 순수한 양전하는 1이다. 

여기에 염기를 첨가하면 카르복실기에서 양성자를 잃고 음전하의 카르복실기가 되며, 용액의 pH는 상승한다. 알라닌은 이제 순수한 양전하를 가지고 있지 않게 된다. 염기를 계속 첨가하여 pH가 상승하면 양성자를 가지고 있던 아미노기는 양성자를 잃게 되고, 알라닌 분자의 음전하는 1이 된다. 알라닌의 적정 곡선은 2염기 산의 곡선을 그린다. 그러므로 아미노산 B는 알라닌이다.

 

히스티딘 역시 적정 곡선을 그리는 작용기이다. 아주 낮은 pH 상태의 히스티딘 분자는 이미다졸과 아미노기가 모두 양전하를 띠기 때문에 순수한 양전하 2를 갖는다. 여기에 염기를 첨가하면 pH는 상승하게 되고, 카르복실기는 하나의 하전된 이미다졸이 양성자를 방출하게 되고, 히스티딘이 전하를 갖지 않는 지점에 도달한다. 분자는 음전하 1을 나타낸다. 히스티딘의 적정 곡선은 3염기 산의 곡선을 그린다. 그러므로 아미노산 A는 히스티딘이다.

 

아주 낮은 pH상태의 글루탐산 분자는 아미노기가 양전하를 띠고 있어 양전하 1을 갖는다. 염기를 첨가하면 카르복실기는 양성자를 방출하게 되고 작용기에서도 양성자를 방출하게 되어 분자는 음전하 2를 갖게 된다. 글루탐산의 적정 곡선은 3염기 산의 곡선을 그린다. 나머지 아미노산 C는 글루탐산이 된다.

 

참고 문헌

1. 대사를 중심으로한 생화학, 이주희 외 4, 2013, 교문사

2. 생화학, Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell, 곽한식, 김재원, 김하근, 2009, 라이프 사이언스

3. 레닌저 생화학 제5판, 월드 사이언스, David L. Nelson, Michael M. Cox, 2010, p.72~77

4. 생화학의 이해, 로드니 보이어, 2004, p.70~p.76