[일반생물학실험]완충액의 제조와 산도측정

실험 목적

수용액의 pH의 완충작용의 원리를 학습함으로써 생체 내에서 일어나는 수소이온농도조절을 통한 생물체의 항상성 유지 기작에 대해 알아보는 것이다.

 

실험 이론 및 원리

1. 실험 배경

완충용액이란 일반적으로 약산이나 약염기와 그 염을 포함하는 용액이며 소량의 산이나 염기를 첨가하여도 pH변화에 저항하는 능력을 가진 용액이다. 산성이나 염기성이 용액에 갑자기 가해지면 수용액의 성질이 급격하게 변하는데 인체 내에서는 이러한 성질은 위험하다.

 

효소는 주성분이 단백질로 되어있어 pH에 효소 단백질의 입체 구조가 변하여 효소의 활성이 떨어진다. 완충제(buffer)는pH변화를 최소화하는 물질로 화학적 및 생물학적으로 매우 중요하다. 인체에서 pH는 체액에 따라서 다양하게 변한다. 예를 들면, 혈액의 pH는 약 7.4이고(정상범위: 7.35~45), 위액의 pH는 약1.5이다. 따라서 효소의 적절한 기능과 삼투압의 균형에 중요한 pH값은 대부분 완충 용액에 의하여 일정하게 유지한다.

 

여기서 pH척도는 수용액에 들어있는 수소이온(H+)의 양으로 결정되며, 수용액의 수소 이온 농도는 다음과 같이 pH로 표시한다. pH = -log[H+] = -log[H3O+], 범위는 0에서 14로0은 가장 강산, 14는 가장 염기성을 나타내는데 [H+]↑ → pH↓, [H+]↓ → pH↑이므로 pH가 1단위씩 감소하면 [H+]농도는 10배씩 증가한다. (pH=3→2, [H+]=0.001→0.01)

 

완충용액은 일반적으로 약산과 그 짝염기(약산의 염)을 일정 pH가 되도록 몰농도 비율을 맞춰 용액을 만들면 된다. 만일 산과 그 짝염기의 몰농도가 거의 같다면 pH= 약 pKa이다. 완충용액이 효과적으로 작용하기 위해서 산의 농도는 대략적으로 짝염기의 농도와 같아야 한다.

 

2. 실험 요약

실험은 시약 5종(증류수, 0.1 N HCl, 0.1N NaOH, 0.1M NaH2PO4, 0.1M Na2HPO4)을 사용하였으며 마이크로파이펫, pH meter의 방법을 통해 pH를 측정하였다. 실험 결과로 증류수 20㎖의 pH값은 6.89로 중성(pH=7)과 같은 값을 얻었다. 증류수에 0.1㎖ 0.1N NaOHl (강염기)을 섞었더니 pH 값은 6.78→8.74로, 증류수에 0.1㎖ 0.1N HCl (강산)을 섞었더니 pH값은 6.78→5.16으로 급격하게 pH가 변했다. 반면, 다른 그룹 실험 결과를 참고하면 0.1M 인산완충액에다 각각 용액을 넣었을 때 pH값은 크게 변하지 않았다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

1) pH미터(pH meter), 50㎖ tubes, 20㎖ pipette, 0.2㎖ pipette

2) 0.1N HCl, 0.1N NaOH, 0.1M NaH2PO4, 0.1M Na2HPO4

 

실험 방법

1. pH 4 완충용액 제조

1) pH 6.8인 0.1M 완충액 50㎖를 만들기 위하여 필요한 0.1M NaH2PO4와 0.1M Na2HPO4를 정하고, 각 용액을 섞어서 완충액을 만든 다음, pH를 측정하여 예측된 pH값과의 차이를 조사한다.

2) 제조한 0.1M 완충액을 1:10, 1:100, 1:1000이 되게 증류수로 희석하여 각 희석액의 pH를 측정한다.

 

2. pH의 측정

아래 용액을 50㎖ tube에 넣고, pH미터 또는 pH측정 용지를 이용하여 측정한다.

1) 증류수 20㎖

2) 20㎖의 증류수 + 0.1㎖의 0.1N HCl (분자량 36.46)

3) 20㎖의 증류수 + 0.1㎖의 0.1N NaOH (분자량 40)

4) 0.1M의 인산완충액(pH 7.4) 20㎖

5) 0.1M의 인산완충액(pH 7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1N HCl

6) 0.1M의 인산완충액(pH 7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1N NaOH

 

주의 사항

1. 파이펫

1) tip을 장착한 후 사용한다.

tip을 장착하지 않은 채 사용하면 용액이 마이크로피펫 내부로 들어와 용액에 의해 오염된다. 또한 부품에 손상을 주게 된다.

2) 마이크로피펫의 용량을 지켜서 사용한다.

각 마이크로피펫은 사용할 수 있는 용량이 정해져있다. 따라서 정해진 용량보다 미만 또는 초과하여 사용할 경우tip으로 들어오는 용량이 정밀하지 못하게 된다.

3) tip끝을 용액에 충분히 잠기도록 하여 사용하고, 취하고자 하는 용량만큼 용액이tip안으로 유입될 때까지 충분한 시간을 주도록 한다.

tip 끝을 용액의 표면과 가까이 잠기도록 하여 사용하면, tip안으로 용액이 유입되다가tip 끝이 용액의 표면 밖으로 노출되면서 공기가 함께 유입되어 원하는 용량만큼의 용액을 취하지 못하는 현상이 발생한다.

 

2. pH미터

1) pH 전극의 센서 부분은 항상 젖은 상태로 보관해야 한다. 공기 중에 노출시킨 상태에서 보관하면 유리 전극의 멤브레인이 막혀 전극을 쓰지 못하는 상태가 된다.

2)  증류수나 초준수 등 물에 절대 보관하지 않는다. 유리 전극의 멤브레인을 통해 기준 전해액이 유출되어 전극의 노화가 촉진되고 응답속도가 늦어진다.

3)  pH미터는 세척이 중요한데 전극을 교정하기 전, 사용 전과 후에 증류수로 세척하고 실험실 페이퍼로 살살 물기를 제거해야한다. 큰 압력으로 물기를 제거하는 행동은 장치에 좋지 않다.

4)  강산성이나 강알칼리에서는 사용하지 않도록 한다.

 

실험 결과

1. pH 보정작업

pH미터에서 칼리브레이션(Calibration) 누르면 보정할 수 있게 된다.

노란색(중성)용액에 전극을 담구면 오차만큼 수정이 되고 증류수로 세척한 후 빨간색(산성)용액에, 다시 증류수로 세척 후 파란색(염기)용액에 담구면 오차만큼 수정되어 대체로 정확한pH측정이 가능해진다.

 

2. pH 측정

시약 : 증류수20㎖, 증류수20㎖ + 0.1㎖의 0.1 N HCl, 증류수 20㎖ + 0.1㎖의 0.1 N NaOH, 0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 20㎖, 0.1M 인산 완충액(pH7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1 N HCl, 0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1 N NaOH

 

시약	pH 값
증류수 20㎖	6.78
증류수 20㎖ + 0.1㎖ 0.1N HCl	5.16
증류수 20㎖ + 0.1㎖의 0.1 N NaOH 8.74	8.74
0.1M 인산완충액(pH7.4) 20㎖	7.19

1) 증류수 20㎖의 pH=6.89로 중성(pH=7)과 같은 값을 얻었다.

2) 증류수에 0.1㎖ 0.1N NaOHl (강염기)을 섞었더니 pH값은 6.78 → 8.74으로 변했다.

3) 증류수에 0.1㎖ 0.1N HCl (강산)을 섞었더니 pH값은 6.78 → 5.16으로 변했다.

4) 0.1M 인산 완충액 20㎖는 pH=7.19로 주어진 pH보다 낮게 나왔다.

 

3. pH6.4 완충용액의 제조

1000배 희석은 실험적 문제로 발생한 오차이다.

시약	pH값
0.1M NaH2PO4 25 ㎖ + 0.1M Na2HPO4 25 ㎖	pH 6.91
10배 희석	pH 7.05
100배 희석	pH 7.11
1000배 희석	pH 6.8

 

4. pH측정 비교(다른 그룹 결과)

시약	pH 값
증류수 20㎖	6.79
증류수 20㎖ + 0.1㎖의 0.1N HCl	3.40
증류수 20㎖ + 0.1㎖의 0.1N NaOH	11.05
0.1M 인산완충액(pH7.4) 20㎖	7.47
0.1M 인산완충액(pH7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1N HCl	7.41
0.1M 인산완충액(pH7.4) 20㎖ + 0.1㎖ 0.1N NaOH	7.43

 

토의 사항

1. pH의 측정

다른 그룹과 비교했을 때 실험 결과는 처음부터 잘못되었다. 증류수 20㎖에 0.1㎖ 0.1N HCl 강산을 섞었을 때 산의 세기가 증가해야 하는데 pH6.78→5.16로 상당한 차이가 나지 않았음을 확인할 수 있다. 또한, 증류수 20㎖에 0.1㎖ 0.1N NaOH 강염기를 섞었을 때 pH6.78→8.74로 염기의 세기가 약한 것을 확인하였다.

실험의 실패 이유를 살펴보았을 때, 전극을 시약에 담구고 pH 측정을 하고나서 또 다른 용액에 담구기 전 증류수로 깨끗이 세척 후 담가야 했는데 전극에 시약이 그대로 남아 pH의 측정을 방해하였던 것으로 생각된다. 또한 pH미터의 응답속도가 늦어져 다른 시약들의 pH의 값을 측정할 수 있는 시간이 없어 급하게 종료하여 제대로 된 측정값이 나오지 않았던 것 같다.

 

2. 완충액의 조제

완충용액을 제작할 때 두 용액(NaH2PO4, Na2HPO4)을 각각 25㎖씩 섞어주었다. 그 이유는 pH 6.8인 0.1㏖에 해당하는 완충액 50㎖을 만들기 위해서 식을 세우면 HPO42- → H+ + H2PO4- ; pKa=6.8 과 같다.

6.8 = 6.8 + log[HPO42-]/[H2PO4-]

log[HPO42-]/[H2PO4-] = 0, [HPO42-]/[H2PO4-] = 1

[HPO42-] : [H2PO4-] = 1 : 1

이다.

따라서 NaH2PO4와 Na2HPO4 두 용액을 각각 25㎖ 섞으면 pH 6.8인 0.1㏖에 해당하는 완충액 50㎖이 만들어진다.

pH = pKa + log[HPO42-]/[H2PO4-]식에 의하면 증류수로 1:10 희석했을 때 완충액의 pH는 용액의 이온 강도에 매우 크게 의존하기 때문에 물로 희석하면 이온 강도가 낮아지므로 시작 완충액(pH6.8)에 비해 pH가 증가할 것이다. 1:100으로 희석했을 때의 완충액은 증류수로 1:10만큼 희석한 완충액보다 pH는 더욱 증가하는 것으로 예측했고 결과 또한 그렇게 나왔다.

 

3. 결론

결과를 종합하였을 때 0.1M 인산완충액(pH7.4)에 0.1㎖ 0.1N HCl(강산)을 섞었을 때 pH값이 크게 변하지 않았다. 마찬가지로 인산 완충액(pH7.4)에 0.1㎖ 0.1N NaOH(강염기)을 섞었을 때 pH값이 크게 벗어나지 않는 것을 알 수 있다. 따라서 완충액은 pH변화를 최소화하도록 도와준다. 인체는 생명을 유지하기 위하여 대사를 하는데, 물질대사에는 효소가 필요하다. 대부분의 효소는 단백질이며 pH는 효소의 형태에 영향을 주어 효소의 기능에 영향을 미치기 때문에 완충액이 생물체 내로 약간의 산 혹은 염기가 들어와도 공통 이온 효과에 의해 그 용액의 pH(수소 이온 농도)가 크게 변하지 않고 일정한 pH7.4(정상범위: 7.35~7.45)를 유지할 수 있게 도와주어 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다.

 

참고 문헌

1. 송대빈,정효석,조성환,and 정준호. "완충용액과 효소 · 기질 반응조건에 따른 효소활성도 특성." 농업생명과학연구, 39.4, 39-47 (2005).

2. 최현주, 완충용액의 pH 조절 및 SDS 계면활성제를 이용한 마이크로칩에서의 단백질 분리분석에 관한 연구, 8(9), 777-785 (2018).

3. Hyun-Jae SHIN, Enzyme Nutrition and Enzyme Therapy. 한국생물공학회 학술대회, 123, (2011).

4. Eddowes, M. J., “Response of an enzyme-modified pH-sensitive ion-selective device; analytical solution for the response in the presence of pH buffer,”Sensors and Actuators. Elsevier BV, 11(3), pp. 265–274 (1987).

5. Ratmond Chang 외 1, General Chemistry: The Essential Concepts. 7, 556-568 (2015)

6. Caliendo, A. M. et al. Better tests, better care: improved diagnostics for infectious diseases. Clin. Infect. Dis.57, S139–S170 (2013).