[생화학실험]RNA Polymerase 분리 정제

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

① PMSF - phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride

MW=174.94g/㏖, 단백질 분해 효소 저해제로서 원하는 protein의 degradation을 방지한다. 매우 unstable하여 온도와 pH에 따라 분해되기 쉽다.

 

② Leupeptin

방선균에서 유래된 단백질가수분해효소억제제의 일종으로 N말단이 아세틸기로 막혀 있는 것과 프로피오닐기로 막혀 있는 것이 있다. 구조는 아세틸-L-류실-L-알르기날이다. 특히 활성발현에 있어서는 알데히드기가 필수적이고 산화및 환원에 의해서 활성을 잃는다.

③ Sodium deoxycholate

detergent 중 하나로, cell wall 성분을 녹인다.

 

④ Ammonium sulfate

고농도의 염 용액 속에서는 Protein은 뭉쳐서 침전하는 경향이 있다. 이러한 기술을 'Salting Out'(Salting out effect - Protein은 구조상 hydrophobic한 부분은 분자의 내부에 위치하고 hydrophilic한 부분은 분자의 밖에 위치하여 물과 결합되어 안정을 유지한다. 여기서 Ammonium Sulfate는 염의 종류로 침출 효과, pH의 다양성, 고도의 용해성, 용액의 저열, 저가 등과 같은 많은 유용한 특성들과 연관되어 있다.

 

⑤ PEI

PEI는 많은 branched organic polymer를 가지고 있다. 각 branch마다 질소 원자가 포함되어 있어 상당히 높은 양전하를 띄게 되는데, 이렇게 높은 질소 원자의 분포는 다양한 구조를 가지지게 되고 또한 완충 작용을 해주므로 다양한 pH에서 안정적이다.

 

⑥ Sephadex

세균 Leucostoc nesebteriodes 가설탕에서 합성하는 덱스트란(분지하는 D-포도당 중합체로 주사슬은 α1→6결합, 분기점은 α1→3결합으로 구성된다)을 에피클로로히드린으로 가교하여 비즈모양으로 성형한 친수성겔. 화학적으로 안정하며, 흡착이 적고 저압에서의 겔여과에 최적인 겔로서 널리 사용하고 있다. G-10부터 G-200까지 가교도의 차이에 따라 여러 가지 종류가 있다. 이들 분획범위는 전체적으로 펩티드, 단백질에 대해 분자량이 수백에서 60만에 이른다.

 

실험 방법

1. Cell lysis

① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26㎖ 분주하여 섞는다.

② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6㎖ lysozyme에 분주한 다음, 66㎖ PMSF와 33㎕ leupeptin도 첨가한다. (20min 반응시간 준다.)

③ 20min 후, 3㎖ 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.

④ 20min 후, 50㎕ PMSF 첨가하고 5.6㎖ 2M Ammonium S㎕fate 첨가한다.

⑤ Total volume 56㎖ 까지 Buffer LB를 첨가한다.

⑥ 5.6㎖ 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다.

⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.

⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46㎖) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.

⑨ 12.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.

⑩ supernatant는 버리고 17㎖ lysis buffer (1X Buffer C + 100mM NaCl) 첨가하여 용해시킨다.

⑪ 투석 시 사용하는 membrane을 미리 D.W에 담근다. (3.3㎖/1㎝)

⑫ protein solution을 membrane에 넣고 clip으로 잡은 후 4도, chamber에서 O/N

 

2. Cell Purification

① 단백질을 4도, 12000g에서 20분 Centrifuge한다.

② Supernatant만 비커에 담고 50㎕ PMSF 첨가한다.

③ Colom에 위의 solution을 흘려보낸다. 흘려나오는 Buffer을 비커에 담는다. (50㎖; loading eluent)

④ Washing Buffer 120㎖을 흘려보낸다. (200㎖; Washing eluent)

⑤ Elution Buffer 200㎖을 흘려보낸다. (200㎖; Eluted protein)

 

실험 결과

1. 결과 분석

 

토의 사항

1. 실험 고찰

자란 cell을 통해 원하는 T7 RNA polymerase가 생겼는지 확인하기 위하여 먼저 cell lysis를 한다. Buffer LB(EDTA 포함)와 lysozyme, PMSF, leupeptin을 첨가하면 EDTA가 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때, 세포의 형태를 유지하기 위하여 lysozyme도 함께 넣어주고, 단백질이 분해되지 않도록 PMSF와 leupeptin도 넣어준다. DTT는 DNA를 석출시키는데 사용되며 더 완벽한 용해를 위하여 sodium deoxycholate을 첨가한 뒤 centrifuge하면 원하는 단백질이 supernatant에 녹아 있게 된다. 수화되어 있는 단백질을 ammonium sulfate을 이용하면 염석 효과에 의해 target protein이 pellet 형태로 얻어지게된다.

 

여기에 lysis buffer을 이용하여 단백질을 다시 용해시키고 membrane을 이용하여 투석시킨다. 염석을 통해 얻은 단백질 용액에는 무기염이 많이 존재하기 때문에 단백질 수용액을 투석하면 무기염을 제거할 수 있게된다. salt을 제거한 lysate를 통해 단백질을 정제하기 위하여 column chromatography를 한다. Sephadex C-50 ion exchange chromatography를 하였다. Lysate를 colum에 내리게 되면 SP가 (-)charge를 띠고 있으므로 등전점보다 낮은 pH에 존재하여 (+)charge를 띠는 단백질을 잡게 된다. washing buffer로 흡착되지 않은 것들을 내린 다음, Elution buffer을 이용하여 흡착되어 있던 단백질을 내린다.

 

이러한 원리로 1번 lane부터 순서대로 lysate, loading, washing, elution buffer을 내려 SDS-PAGE를 하였다. 2번 lane까지 T7 RNA polymerase가 뚜렷하게 나타나는 것이 관찰된다. T7 RNA polymerase의 단백질 크기는 marker를 기준으로 72-93kDa의 band 사이에 존재하므로 약 82kDa정도라고 확인할 수 있다. Lysate의 경우 T7 RNA polymerase 뿐만 아니라 다른 여러 가지 물질이 섞여 있는 것이 보인다.

 

loading한 것에서도 T7 RNA polymerase 보이는데 원래는 resin에 단백질이 붙어서 band가 나오지 않아야 하는데 이 때 이미 buffer을 따라 나와서인지, 원래 band가 나와야할 Elution buffer에서 band가 형성되지 않음이 보였다. 이는 우리가 pH를 확인하지 않아 잘 모르겠지만 단백질이 충분히 (+)charge를 띠고 있지 않았을 수도 있고, 조심스럽게 하여 겉으로 보았을 때 resin이 괜찮다고 생각하였으나, buffer을 내리는 과정에서 망가졌을 가능성도 있다.

 

 

참고 문헌

1. 단백질 실험 노트 (상), 김승호 외 1명, 월드 사이언스, 1998, p.30∼31

2. 생화학, Frank B. Armstrong, 청문각, 1992, p.72

3. 생물공학실험서, 한국생물공학회, 자유아카데미, 2000, p.28

4. 식품분석(이론과 실습), 조덕재, 지구문화사, 1990, p.96∼10