[Purification of DNA from Living Cells] Total cell DNA의 분리 - 2부

세포 추출물로부터 DNA의 정제

원심분리에 의해서 세포 찌꺼기를 제거한 후에도 용액에는 DNA뿐 아니라 다량의 단백질과 RNA가 포함되어 있다.

Fig. 1 Two approaches to DNA purification. (a) Treating the mixture with reagents which degrade the contaminants, leaving a pure solution of DNA. (b) Separating the mixture into different fractions, one of which is pure DNA .

1. 단백질 제거(Removing contaminants by organic extraction and enzyme digestion)

페놀 또는 페놀:클로로포름(phenol:chloroform)(1:1)을 첨가.

페놀은 유기용매로써 단백질을 변성, 침전시킴

Fig. 2 Removal of protein contaminants by phenol extraction.

한번의 페놀 처리로 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, 여러번 반복수행한다. 그러나 반복될수록 DNA가 절단될 가능성이 높아지기 때문에 단백질 분해효소(protease)를 처리하기도 한다.

① 페놀(1 Vol.) 처리 : 페놀은 비중이 높아서 가라 앉는다.

② Bacillus subtilis는 단백질 분비량이 많기 때문에 protease를 처리하는 것이 통상적이다.

2. RNA 제거 : RNase 변성후에도 재생 가능(단백질 중 유일한 경우임)하며, 혹시 DNase가 포함되어 있을까봐 100℃ 가열 후 사용함.

(RNA 분해효소)(Using ion-exchange chromatography to purify DNA from a cell extract)

어떤 RNA분자(mRNA)는 페놀 처리에 의해 제거되지만, 나머지는 그렇지 않으며 이들은 RNase(ribonuclease)를 이용하여 분해시킨다.

Fig. 3 DNA purification by ionexchange chromatography. (a) Attachment of DNA to ion-exchange particles. (b) DNA is purified by column chromatography, The solutions passing through the column can be collected by gravity flow or by the spin column method, in which the column is placed in a low-speed centrifuge.

DNA 샘플의 농축

가장 자주 사용되는 농축방법은 에탄올 침전법[ethanol(EtOH) precipitation]이다.

1) DNA : 음전하를 띠고 있음

2) 양전하를 띤 이온(1가의 양이온)을 이용

3) Ethanol(100%) 2 vol. 첨가

Fig. 4 DNA purification by ion exchange chromatography. (a) Attachment of DNA to ion-exchange particles. (b) DNA is purified by column chromatography, The solutions passing through the column can be collected by gravity flow or by the spin column method, in which the column is placed in a low-speed centrifuge.

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[Biology/Molecular Biology] - [Purification of DNA from Living Cells] Total cell DNA의 분리 - 3부