[Purification of DNA from Living Cells] Total cell DNA의 분리 - 1부

세균 세포의 배양물로부터 total DNA를 준비하는 방법은 4 단계로 나눌 수 있다.

1. 세포배양액 : 증식, 수확(원심분리 이용) 

2. 세포파괴 : 내용물 방출

3. DNA만 분리 : 단백질 제거(페놀 처리), RNA제거(Rnase 처리) 

4. DNA 농축 : 2 Vol.의 에탄올(EtOH) 처리

Fig. 1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteria.

세균 배양물의 증식 및 수확

1. Defined medium : 배지의 모든 구성성분이 알려져 있는 배지로 정밀하게 통제되는 조건에서 세균 배양물을 증식시켜야 할 때 사용

2. Undefined medium : 배지의 구성성분에 대한 자세한 성분명과 함량이 알려져 있지 않은 배지로 단순히 DNA분리를 위한 경우에 적절 

Medium	component	g/l of medium
M9 Medium	Na2HPO4	6.0
	KH2PO4	3.0
	NaCl	0.5
	NH4Cl	1.0
	MgSO4	0.5
	Glucose	2.0
	CaCl2	0.015
LB(Luria-Bertani medium	Tryptone	10
	Yeast extract	5
	NaCl	10

37℃, LB 배지, 150～250 rpm shaking incubator에서 E. coli의 generation time(doubling time)은 20분이고 최대 밀도(maximum density)인 약 2～3×109cells/㎖에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600㎚)으로 알 수 있다.

수확은 late log phase 때 수행하는 것이 권장되고 있고, 형질 전환시에는 early log phase 때 즉 A600= 0.4 A600= 1 OD → 0.8 × 109cells/㎖ 일 때의 배양물을 사용한다.

적당히 증식된 세포를 원심분리 튜브(centrifuge tube)로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 펠릿(pellet)을 작은 부피로 재현탁(resuspend) 시킨다.(배양액 1000㎖을 원심분리시킨 경우 pellet에 10㎖ 또는 그 이하의 배지를 붓고 재현탁 시킴)

Fig. 2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical density(OD). (a) A sample of the culture is placed in a glass cuvette and light with a wavelength of 600㎚ shone through. The amount of light that passes through the culture is measured and the OD (also called the absorbance) calculated as 1 OD unit = -log10 (intensity of transmitted light)/(intensity of incident light). The operation is performed with a spectrophotometer. (b) The cell number corresponding to the OD reading is calculated from a calibration curve. This curve is plotted from the OD values of a series of cultures of known cell density. For E. coli, 1 OD = unit 0.8×109 cells/mt.

Fig. 3 Harvesting bacteria by centrifugation.

세포 추출물의 분리

세포 추출물을 얻고자 할 때 몇 가지 장벽이 있다. 세포막, 세포벽, 그람 음성 세균인 경우 outer membrane 세균 세포를 파괴시키는 방법에는 2가지가 있다. 

1. 물리적 방법(physical methods) : 기계적인 힘으로 파괴하는 방법 

2. 화학적 방법(chemical methods) : 세포 장벽(cell barrier)을 붕괴시키는 화학제를 사용하는 방법으로서, DNA분리를 위해 가장 일반적으로 사용되고 있다. 

① lysozyme : 계란 흰자, 눈물, 타액(침)에 존재하는 효소로서, 세균 세포벽을 구성하는 중합체인 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 β(1, 4)glycosidic bond를 절단

② EDTA(EthyleneDiamine TetraAcetate) : 세포벽의 전체구조를 유지시키는데 필수적인 Mg 이온을 제거하여 세포벽을 불안정화시키고, DNA분해효소를 불활성화시킴

③ SDS(Sodium Dodecyl Sulphate) : 세포막의 지질분자 제거

Fig. 4 Preparation of a cell extract. (a) Cell lysis. (b) Centrifugation of the cell extract to remove insoluble debris.

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