[아미노산과 단백질 화학]단백질(Protein) - 3부

단백질의 화학적 성질

1. 용해도

단백질의 용해도는 단백질의 종류에 따라 물, 묽은 산, 묽은 알칼리, 염용액, 유기용매에 대한 용해도가 각각 다르며 이것은 단백질을 분류하는 기준이 되기도 한다. 단백질을 여러 농도의 용액으로 만들어 윈심분리한 다음 상등액에 녹아 있는 단백질의 양을 Kjeldahl법 또는 질소원소분석 장치로 정량하면 단백질의 용해도를 알 수 있다.

2. 단백질의 등전점

단백질도 아미노산과 마찬가지로 양성전해질이며 단백질 분자를 구성하는 아미노산 잔기가 어떤 것이라도 분자 전체의 전하를 0으로 하는 수용액의 pH 값으로 표시되는 등전점(pI)을 가진다.(그림 1 참조) 이 등전점의 차이를 이용해서 전기영동(electrophoresis)으로 대전상태가 다른 단백질을 분리하거나 정제할 수 있다. 

등전점에서 단백질은 물에 대한 용해도가 최소로 된다. 이 때 단백질 수용액에 황산암모늄과 같은 중성염을 첨가하는 것에 의해 수화층으로 둘러싸인 물 속에 안정하게 존재하는 친수성 colloid 입자인 단백질 분자는 그 전하가 중화되는 것과 동시에 탈수에 의해 수화층이 떨어져서 단백질 colloid 입자를 응집, 침전시킨다. 이것을 염석(鹽析, salting out)이라 하며 이 방법으로 등전점에 있는 단백질만을 침전시킬 수 있다.

그림 1 여러 가지 단백질의 등전

3. 단백질의 변성

가열, 동결, 고압, 자외선, X-선, 교반, 흡착, 희석 등의 물리적 요인이나 극단적인 산성 또는 알칼리성, 유기용매, 중금속염, 요소, 염산-구아니딘(guanidine-HCl) 등의 변성제나 계면활성제 등의 화학적 요인에 의해 1차구조는 변화시키지 않고 고차구조가 파괴되어 단백질분자가 대부분 생리적 조건에서 유지하고 있는 고유의 구조상태의 물성이 변화한 상태로 되는 것을 변성(denaturation)이라 한다. 

그림 2 단백질의 변성과정

단백질이 변성되면 대부분의 이온결합, 수소결합, 소수성결합, disulfide 결합이 파괴되어 SH-기가 증가하고 분자량이 변화하기도 한다. 또 아미노산 잔기 자신의 분자내 반응으로 산성기 또는 염기성기가 감소하고 polypeptide 사슬은 무질서한 상태(random coil)로 된다.(그림 2 참조) 

단백질이 변성되면 용해도의 감소, 응고와 gel화, 등전점 이동현상이 일어나고 효소활성, 항원성 등의 생리적 활성을 잃게 된다. Trichloroacetic acid, 인텅스텐산(phosphotungstic acid), 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) 등으로 단백질을 변성시키면 침전되므로 원심분리하여 단백질을 제거할 수 있다.

4. 아미노산과 단백질의 분석

1) Ninhydrin 반응

아미노산과 ninhydrin을 가열 반응시키면 그림 3에 나타낸 것처럼 아미노산의 산화분해가 일어나 환원된 ninhydrin과 암모니아, 이산화탄소, aldehyde가 생성되며 다음에 환원된 ninhydrin과 암모니아, ninhydrin이 반응하여 Ruhemann's purple이라는 청자색의 색소가 생성한다.

그림 3 아미노산의 ninhydrin 반응

그 외에도 여러 가지 색소가 생성하나 이것이 주된 생성물이다. 아미노산에서의 발색은 보통 자색이지만 histidine, glycine에서는 적회색, phenylalanine, tyrosine, aspartate는 청색, proline은 황색으로 발색된다. 2㎍～0.2㎍의 아미노산을 검출할 수 있다. 이 반응은 peptide와 단백질에서도 일어난다.

2) Kjeldahl법

보통 단백질의 질소함량은 약 16%(12～19%)이므로 질소함량을 정량하여 단백질량을 구하는 방법이 고안되어 있다. 단백질 함유시료를 진한황산 중에서 가열분해하면 유기화합물 중의 질소는 암모니아로 되고 황산암모늄으로 반응액 중에 남는다. 분해반응 후 용액을 알칼리성으로 하여 유리하는 암모니아를 수증기와 함께 증류하고 산성용액에 다시 흡수시켜 적정, 비색 등의 방법으로 정량한다. 

이렇게 하여 얻어진 암모니아량으로부터 시료 중의 단백질량을 계산하는 방법이 Kjeldahl법이다. 시료 중에 단백질 이외의 함질소화합물이 있는 경우나 질소함량이 매우 많거나 적은 단백질의 경우는 오차가 크게 된다. 이 방법은 감도가 좋고 식품과 같은 단백질 혼합물의 단백질함량을 분석하는데 적당하다.

3) Biuret법

알칼리성 수용액 중에서 2가의 구리이온과 biuret(NH₂-CO-NH-CONH₂, 요소가 carbamyl화된 화합물)는 착화합물을 만들어 적자색을 나타낸다. 단백질의 알칼리성 수용액에 황산구리를 가하면 단백질분자 중에 많이 존재하는 아미드기와 구리이온이 biuret-구리이온 착체와 같은 착화합물을 만들어 자홍색~청자색의 용액으로 된다.

단백질 이외의 물질에서 이 발색반응이 일어나는 경우는 드물기 때문에 이 발색반응을 이용하면 시료 중의 단백질량의 정량을 할 수 있다. 발색한 용액의 흡광도를 파장 540～560nm에서 측정하고 표준물질과 비교하면 시료 중의 단백질을 정량할 수 있다.(비색정량법)

4) Phenol 시약법

Phenol류와 반응하여 발색하는 시약을 phenol 시약이라 하며 특히 Folin의 시약이 단백질 정량에 자주 이용된다. Folin 시약은 주로 몰리브덴산나트륨, 텅스텐산나트륨과 인산으로 만들며 환원제와 반응하여 복잡한 착체인 인몰리브덴산 블루를 형성하여 청색을 나타낸다. 

단백질 분자 중의 tyrosine(phenol의 일종), tryptophan은 산화되기 쉬워서 환원제로 작용하며 이들 아미노산을 함유하는 단백질은 Folin 시약으로 발색, 정량할 수 있다. Folin의 방법을 biuret법과 조합시켜 감도를 향상시킨 Lowry법도 단백질의 정량에 많이 이용된다. 

5) 자외선 흡수 spectrum을 이용하는 방법

방향족아미노산인 tryptophan, tyrosine, phenylalanine은 280nm 부근 파장의 자외선을 흡수한다. 이들 아미노산이 단백질 중에 함유되어 있는 경우 단백질 용액의 280nm에서의 흡광도를 측정하면 단백질 농도를 산출할 수 있다. 이 방법은 매우 간편하지만 자외선을 흡수하는 물질이 시료에 공존하는 경우에는 이용할 수 없다.

[Biology/Biochemistry] - [아미노산과 단백질 화학] 단백질 - 1부

[Biology/Biochemistry] - [아미노산과 단백질 화학] 단백질 - 2부

[Biology/Biochemistry] - [아미노산과 단백질 화학] 단백질 - 4부