[아미노산과 단백질 화학]단백질(Protein) - 4부

단백질의 정제

세포에는 수많은 종류의 단백질이 함유되어 있다. 단백질의 아미노산 조성이나 배열을 결정하고 성질을 규명하는 등 단백질에 대한 연구를 위해서는 먼저 어떤 세포 또는 조직에 있는 다양한 물질로부터 단백질을 분리, 정제하여 순수한 단백질을 얻는 것은 필수적인 과정이다.

1. 추출 및 가용화

식물, 동물, 미생물 등의 조직, 세포 중의 단백질을 용액 중에 추출하는 것으로 정제과정이 시작된다. 조직이나 세포를 기계적인 힘으로 파쇄하여 단백질을 완충액 중으로 추출하는 경우가 많으며 세포 잔사는 원심분리하여 제거하고 상등액 중의 단백질혼합물은 다음 정제단계로 넘긴다. 어떤 종류의 단백질은 세포막 획분에 강하게 결합하고 있어 이것을 가용화하기 위해서는 여러 가지 계면활성제를 사용하거나 유기용매로 막구분을 녹여서 추출하는 경우도 있다.

2. 염석 및 유기용매에 의한 침전

염석은 물에 잘 용해하는 염(황산암모늄 등)을 단백질혼합액에 가하여 이온강도를 증가시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 만약 목적으로 하는 단백질이 황산암모늄 60% 포화 때 주로 침전하는 것을 알면 미리 60% 포화 이하의 황산암모늄 농도로 목적 이외의 단백질을 침전시켜 제거하고 다음에 60% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여 목적하는 단백질을 침전시키고 이것을 원심분리로 모은다. 

염석 조작은 정제의 초기 수단으로 흔히 이용된다. 유기용매에 의한 침전은 에탄올, 아세톤 등 물과 잘 혼합하는 유기용매를 단백질용액에 가해 용액의 비유전율을 변화시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 유기용매의 농도에 따라 침전되는 단백질의 종류가 다르므로 염석의 경우와 마찬가지로 목적으로 하는 단백질을 다량으로 함유하는 침전구분을 모아 다음 정제단계로 넘긴다. 

3. 투석

염석 또는 유기용매로 침전시켜 모은 단백질에는 아직 불순물로서 기타의 단백질이나 저분자물질, 무기염을 함유하고 있다. 저분자의 불순물을 제거하는 수단으로 흔히 사용되는 것이 투석(dialysis)이다. 무기염류와 저분자물질은 투과하나 단백질이나 고분자물질은 투과하지 않는 작은 구멍을 가진 막(셀로판 튜브 등)에 단백질 용액을 넣어 봉하고 증류수나 완충액 속에 장시간 넣어 두면 저분자물질은 막에서 투과하여 제거된다.(그림 1 참조)

그림 1 단백질 용액의 투석

4. 칼럼크로마토그래피

칼럼크로마토그래피(column chromatography)는 그림 2에 나타낸 것처럼 원통상의 유리관(column)에 충진제를 채우고 분리할 혼합물을 칼럼 중에 흘려서 혼합물 중의 각 물질의 충진제에 대한 상호작용의 차이에 따라 각 성분을 분리하는 방법이다.

분리조작이 목적에 맞는 경우는 각 성분은 칼럼 상에 띠 모양의 밴드를 형성하고 칼럼하부로 순차 유출한다. 이 분리법은 단백질의 정제에 흔히 이용되며 가장 효과적인 방법의 하나이다. 다음에 단백질정제에 흔히 이용되는 칼럼크로마토그래피법을 그 원리에 따라 나누어 설명한다.

그림 2 칼럼 크로마토그래피

5. 이온교환크로마토그래피

단백질은 구성아미노산 중에 산성, 염기성아미노산을 함유하므로 적당한 pH 조건하에서는 양(+) 또는 음(-)의 전하를 가지고 있다. 칼럼에 전해질의 고분자물질을 충진제로 넣고 각종 단백질의 전하량과 충진제의 이온 상호작용의 차이에 따라 단백질을 분획하는 방법이 이온교환크로마토그래피(ion-exchange chromatography) 이다. 

음전하를 가져 양이온을 흡착하는 고분자담체가 양이온교환체(cation exchanger), 양전하를 가져 음이온을 흡착하는 고분자담체를 음이온교환체(anion exchanger)라 한다. 

단백질 정제에 흔히 이용되는 양이온교환체는 carboxymethyl cellulose(CM-cellulose)이며 cellulose의 히드록시기에 carboxymethyl기(-CH₂COO^-)가 부가한 구조를 가져 음전하를 띠므로 양전하를 가진 단백질 분자를 흡착한다.

이에 대하여 음이온교환체로는 diethylaminoethylcellulose(DEAE-cellulose)가 있다. 이것은 cellulose의 히드록시기에 diethylaminoethyl기[-CH₂CH₂N⁺(CH₂CH₃)₂]가 부가된 구조를 가져 양전하를 띠므로 음전하를 가진 단백질을 흡착한다. 이러한 이온교환체를 칼럼에 채우고 단백질 혼합물을 가하여 완충액의 pH 또는 이온강도를 변화시키면서 용출하면 각 단백질을 전하상태에 따라 분획할 수 있다.

6. 흡착 칼럼크로마토그래피

어떤 물질에 대한 여러 가지 흡착력의 차를 이용한 칼럼 크로마토그래피이다. 일반적으로 유기화합물에서는 silica gel과 alumina 충진제가 사용되나 단백질 분리에는 특별한 결정구조를 가진 인산칼슘인 hydroxyapatite[3Ca₃(PO₄)2Ca(OH)₂]가 흔히 이용된다.

7. 겔 여과크로마토그래피(분자체)

겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)는 투석과 마찬가지로 분자를 크기에 따라 분획할 수 있는 방법이다. 가교한 dextran gel(Sephadex), polyacrylamide gel(Bio-gel), agarose gel 등을 작은 입자상으로 가공한 것을 충진제로 이용한다. 

이 고분자 gel의 입자는 다수의 매우 작은 체(篩) 구멍이 있는 작은 공과 같아서 이것을 채운 칼럼에 여러 가지 크기의 분자량을 가진 단백질 혼합물을 가해서 용출시키면 체 구멍보다 큰 지름을 가진 단백질 분자는 확산하지 않고 그대로 칼럼에서 유출하고, 체 구멍을 통과하는 작은 단백질 분자는 충진제 중에 확산하면서 column을 통과하므로 천천히 유출한다. 그러므로 분자의 크기에 따라 단백질을 분획할 수 있다.(그림 3 참조) 이러한 겔 여과 칼럼을 분자체(molecular sieve)라 한다.

그림 3 겔 여과 크로마토그래피에 의한 단백질 분리

체에 해당하는 고분자내의 구멍 크기를 여러 가지로 변화시킨 gel 여과용 충진제가 시판되고 있어 목적으로 하는 단백질의 분자량에 따라 구분하여 사용할 수 있다. 또 겔 여과 칼럼크로마토그래피로 분자량을 알고 있는 몇 가지의 단백질과 함께 분자량을 모르는 단백질을 용출시키고 그 결과를 도표로 작성하면 분자량을 확인할 수 있다.(그림 4 참조).

그림 4 겔 여과크로마토그래피에 의한 단백질 분자량 측정

8. 친화 크로마토그래피

친화 크로마토그래피(affinity chromatography)는 단백질이 어떤 특별한 물질과 강한 친화력에 의해 선택적으로 결합하는 성질을 이용하여 분리하는 것이다. 

고분자 충진제에 목적으로 하는 단백질과 상호작용이 큰 물질(ligand), 예를 들면 효소의 경우 기질이나 저해제로 되는 물질을 공유결합 또는 이온결합과 같이 강한 결합으로 붙이고 이것을 칼럼으로 하여 단백질 혼합물을 가하면 목적으로 하는 단백질만이 충진제 상의 ligand와 결합하여 흡착되고 기타의 물질은 유출한다. 

이와 같이 하여 흡착된 단백질은 칼럼에 다량의 ligand를 함유하는 용매를 가하여 용출하면 분리 할 수 있다. 이상에서 설명한 것 이외에 이온교환체와 gel 여과법을 조합시킨 크로마토그래피나 물질의 소수성, 친수성의 차이를 이용한 분배 크로마토그래피도 있다.

9. 전기영동

전기영동(electrophoresis)은 이온교환크로마토그래피와 마찬가지로 단백질분자의 전하를 이용한 분리, 분석법이다. 단백질 분자는 보통 등전점 이외의 pH에서는 양 또는 음의 전하를 가지고 있어서 일정한 pH의 완충액 중에서 직류전류를 가하면 양극 또는 음극방향으로 이동한다.

즉 단백질 분자의 전하량, 분자의 크기에 따라 전장 중에서 이동하는 속도가 다른 점을 이용하여 분리, 분석하는 것이다. 단백질을 여과지, 전분이나 agarose와 같은 다당류 gel, polyacrylamide gel 등과 같은 것을 담체로 하여 전기영동하면 단백질은 band를 형성하여 분리되므로 분리, 분석조작이 간단하게 된다. 

단백질 분석, 순도 검정, 분리정제에 일반적으로 이용되는 방법은 polyacrylamide gel을 disc 또는 slab으로 만들어 전기영동하는 것이다. 이 방법은 그림 5-(a)에 나타낸 것처럼 가교도와 농도가 다른 2가지의 polyacrylamide gel을 담체로 하고 시료단백질은 상층의 농축 gel 층에 가한다. 전류를 통하면 시료단백질은 농축 gel 중에서 얇은 층으로 되어 분리용 gel로 들어가 분리되는 구조로 되어 있다. 

그러므로 분리된 각 단백질은 그림 5-(b)에 나타낸 것처럼 원반 모양의 얇은 층을 이루는 band로 되며 amidoblack이나 coomassie blue 등의 색소로 염색하면 선명하게 검출할 수 있다.

그림 5 Disc polyacrylamide gel 전기영동 장치

Polyacrylamide gel은 가교도에 따라 분자체와 같은 효과도 나타내므로 분자량이 큰 단백질은 이동속도가 늦어진다. Sodium dodecylsulfate(SDS)와 같은 계면활성제와 단백질의 복합체(SDS-protein complex)를 형성시켜서 단백질 표면을 SDS 분자로 둘러싸면 각종 단백질의 전하량은 균일하게 되므로 이것을 전기영동하면 단백질 분자는 그 크기에 따라서 담체상에서 분리된다. 

분자량을 모르는 단백질을 분자량이 알려진 표준단백질 몇 종류와 함께 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 실시하고 이동거리를 비교하면 분자량을 결정할 수 있다.(그림 6 참조) 그리고 적당한 변성제, 예를 들어 disulfide 결합을 분해할 수 있는 변성제로 단백질을 처리하여 이 방법으로 전기영동하면 oligomer 단백질을 구성하는protomer(subunit)의 수를 알 수도 있다.

그림 6 SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의한 단백질의 분자량 측정

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