[Purification of DNA from Living Cells]플라스미드 DNA의 분리

Total cell DNA 분리 후 염색체 DNA와 플라스미드 DNA를 분리시킨다.

염색체 DNA와 플라스미드 DNA의 차이점 이용

1. 크기 : 가장 큰 플라스미드의 크기는 대장균 염색체 크기의 8%밖에 안됨 

2. Conformation : 분자 전체의 공간적인 configuration. 플라스미드와 세균 DNA는 모두 circular form이지만 분리도중 세균 DNA는 linear form으로 절단된다. 이 차이로 인해 alkaline denaturation, EtBr-CsCl 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 통해 분리 가능

Fig. 1 DNA purification by the guanidinium thiocyanate and silica method.
(a) In the presence of guanidinium thiocyanate, DNA binds to silica particies.
(b) DNA is purified by column chromatography.

크기에 기초한 분리

조심스럽게 세포를 용해시킨다면 세균 DNA의 단편화가 감소하게 되므로 원심분리에 의해 쉽게 플라스미드 DNA를 분리할 수 있다. lysozyme과 EDTA, 그리고 25% 수크로스(sucrose)처리하여 세포를 스패로플라스트[sphaeroplast(partially wall-less cells)]로 만듦. 

sphaeroplast의 세포막을 파괴하기 위해 Triton X-100(non-ionic detergent)처리한다. 그리고 세포 추출물을 원심분리(10,000 rpm, 5~10 min.)를 하면 세포 찌꺼기는 침전, 상층액의 상단엔 cleared lysate(플라스미드 포함)가, 하단엔 큰 DNA 단편들이 존재한다.

그러나 짧게 단편화된 염색체 DNA가 플라스미드와 함께 존재할 수 있으며 플라스미드가 큰 경우에는 세포 찌꺼기와 함께 침전되었을 수도 있다. 즉, 크기에 의해선 완전히 분리할 수 없다.

Fig. 2 Preparation of a cleared lysate

Conformation에 기초한 분리

※ 대부분의 플라스미드 : supercoiled

Fig. 3 Two conformations of circular doublestranded DNA
(a) supercoiled - both strands are intact;
(b) open-circular - one or both strands are nicked.

1) Alkaline denaturation

① 극한 pH 변화 조건에서 non-supercoiled DNA는 변성되고 supercoiled plasmid는 변성되지 않는 성질을 이용한 방법이다.

② main chromosome의 linear dsDNA와 supercoiled plasmid의 혼합액을 pH 12.0~12.5로 만든다. 그러면 linear dsDNA는 변성되어 ssDNA가 된다. 이 혼합액을 pH 7.0으로 만든다(use 3M NaOAc(pH 4.5)) 그러면 linear ssDNA는 무작위적인 수소결합을 형성함으로써 서로 엉키면서 거대한 덩어리를 이루게 된다. 그래서 원심분리하면 상층액에는 supercoiled plasmid가 존재하며 이때 생기는 pellet은 바로 linear DNA이다.

Fig. 4 Plasmid purification by the alkaline : denaturation method.

2) Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation(EtBr-CsCl 밀도구배 원심분리)

① plasmid를 가장 순수하게 분리할 수 있는 방법 

② CsCl density gradient centrifugation에서, 고속(40,000rpm)의 원심분리 안(48hr) 원심력은 Cs과 Cl ion을 튜브(tube)의 바닥쪽으로 당기기 때문에 농도구배가 형성되어 CsCl 밀도는 바닥쪽으로 갈수록 더 커진다. 고분자와 함께 원심분리되면 분자의 고유한 밀도와 동일한 CsCl밀도 위치에 밴드(band)를 형성하게 되며 DNA는 1.7g/㎤, 단백질은 상단부, 그리고 RNA는 바닥에 pellet을 형성하게 된다.

Fig. 5 centrifugation. Caesium chloride density gradient (a) A CsCl density gradient produced by high speed centrifugation. (b) Separation of protein, DNA and RNA in a density gradient.

EtBr과 함께 density gradient centrifugation이 되면 non-supercoiled DNA와 supercoiled DNA를 분리시킬 수 있다. EtBr은 DNA의 염기쌍 사이에 삽입됨으로써 linear DNA는 0.124g/㎤만큼, supercoiled DNA는 0.085g/㎤만큼 밀도를 감소시킨다(부력은 증가).

결과적으로 supercoiled DNA는 EtBr-CsCl gradient에서 linear와 oc(open circular)DNA와는 다른 위치에 band가 형성된다. 그래서 세포 추출물과 함께 EtBr, CsCl를 첨가하고 40,000 rpm 으로 48시간 원심분리시킨다. 

CsCl 밀도구배가 형성되며, EtBr에 의해 부력의 차이가 생긴(DNA 염기 사이에 끼어 들어감으로써 부력 변화시킴) linear &ocDNA는 상단에, supercoiled DNA는 하단에 band를 형성하게 된다.(최상단엔 단백질, 최하단 pellet에는 RNA가 존재)

※ linear and ocDNA : 0.125g/㎤ 밀도 감소, supercoiled DNA : 0.085g/㎤ 밀도 감소

마지막으로 supercoiled DNA의 band만을 주사기로 추출하여 새로운 tube에 옮긴다. DNA 염기사이에 삽입되어 있는 EtBr을 제거하기 위해 n-butanol(n-부탄올)처리하면 반투막 이용하여 투석시킴으로써 CsCl과 DNA를 분리된다.

Fig. 6 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base pairs. The normal DNA molecule shown on the left is partially unwound by taking up four EtBr molecules, resulting in the 'stretched' structure on the right.

Fig. 7 Purification of plasmid DNA by EtBr-CsCI density gradient centrifugation.

플라스미드 증폭

early log phase인 A₆₀₀ = 0.3 일 때 단백질 합성 저해제(chloramphenicol, 클로람페니콜) 첨가

12시간 더 배양하면 플라스미드는 계속 복제된다.

Fig. 8 Plasmid amplification.