[미생물학개론]미생물의 순수분리

소개

미생물은 널리 산재하고 있으므로 순수배양을 하기 위해서는 자연계의 혼합미생물군으로부터 원하는 미생물을 분리하는 것뿐만 아니라 인위적 환경에서 다른 미생물들의 접근을 방지하여 분리한 균주와 그 후손들을 유지, 보존하는 것이 필요하다.

 

미생물은 증식을 위해 많은 공간을 필요로 하지 않는다. 따라서 인위적 환경은 제한된 시험관, 플라스크 혹은 페트리접시내에서 조성 될 수 있으며, 이러한 3가지 종류의 용기가 미생물배양에 널리 사용된다. 배양용기는 처음에 멸균(살아 있는 미생물이 없어야 한다.)되어야 하며, 워하는 종류의 미생물을 접종한 후에도 계속되는 외부의 오염으로부터 보호되어야 한다.

 

미생물의 종류와 분리용 배지
균의 종류	배양기
일반 세균	펩폰 육즙 배양기
파라티프스, 티프스	담즙 배양기, 담즙
아세톤균	옥수수 배양기
효모	고지즙, 맥아즙
산생성균	고지즙, 맥아즙
병원균	혈청
방사선균	차벡크 배양기
사상균	고지즙, 맥아즙

 

외부로부터의 오염의 주요원천은 공기인데, 공기중에는 항상 떠다니는 미생물들이 많다. 뚜껑이 있는 페트리접시는 공기오염을 방지할 수 있도록 특별히 제작된 것이다. 시험관 및 플라스크의 오염은 적당한 마개로 입구부분을 막음으로써 방지될 수 있다. 이러한 마개로는 현재 금속뚜껑이나 플라스틱의 나사뚜껑이 특히 시험관의 경우 많이 사용되지만 전통적으로는 솜마개가 널리 사용되고 있다.

 

물론 배양용기의 외부표면도 오염되기 쉬우며, 플라스크나 시험관의 내부도 물질을 집어넣거나 제거하기 위해 여는 경우에 오염될 수 있다. 이러한 위험은 마개가 제거된 후 즉시 마개를 다시끼울때 입구부분을 불에 통과시킴으로써 극소화시킬 수 있다. 접종원은 보통 사용 직전에 빨리 불로 멸균한 백금침이나 백금이를 이용하여 접종한다.

 

액체배양액은 피펫을 이용하여 옮길 수 있다. 이렇게 하기 위해서는 피펫의 입구 끝부분을 솜으로 막고, 사용할 때까지 내부와 외부의 오염을 방지하도록 피펫을 종이로 싸거나 유리 또는 금속용기에 넣어서 멸균시켜야 한다. 우연한 오염의 위험은 밀폐된 무균상자나 후드에서 세균을 옮겨줌으로써 더욱 감소시킬 수 있다.

 

1. 직접 배양

어떤 시료에서 목적으로 하는 미생물을 혼재 하고 있는 다른 미생물보다 빨리 다량으로 얻은 후에 순수분리를 한다. 목적하는 미생물에 적합한 배지에 시료의 소량(멸균수로 희석한 것)을 넣고, 적온을 유지하여 목적하는 미생물의 생장번식을 왕성하게 하고 잡균을 억제한다.

 

1) 집적 배양용 배지

목적하는 미생물과 해당 배지를 예로 들면 다음과 같다.

① 일반세균 : 육즙펩톤수

② 효모균 : 맥아즙

③ 사상균(곰팡이) : 국즙, 맥아즙

 

2) 도태 배양법

미생물의 특별한 성질을 이용하여 목적으로 하는 미생물만을 생장번식 시킨다.

① 가열에 의한 배양법

시료를 배지에 넣고 일정시간 열처리하면, 아포가 없는 균체, 내열성이 적은 아포 등은 죽고 목적균의 아포만 살아남아서 번식한다.

 

② 화학적 방법

목적하는 미생물의 내산성, 내알코올성, 내당성, 내항생물질성 등과 같이, 어떤 약품에 대한 저항성을 이용하여 잡균의 생장을 억제하거나 제거하고 목적으로 하는 미생물만을 얻는 방법이다. 예를 들면 pH의 변화로 효모, 곰팡이, 세균이 배양된다.

 

③ 동물 통과법

병원균에 많이 쓰는데 결핵균을 몰못에 이식하거나 폐염쌍구균을 흰쥐에 접종하는 방법인데 동물체를 배지로 이용하는 방법이다.

평판법에 의한 순수 배양의 분리

고체배지상에 명확한 콜로니들을 형성하는 미생물들의 순수배양은 평판법의 한 변볍으로 가장 간단하게 얻을 수 있다. 이러한 방법은 한천이나 다른 적당한 응고제를 사용하여 굳힌 영양배지의 내부나 표면 위에서 개개의 생물들을 분리하여 고착시키는 것이다. 각각의 살아 있는 미생물들을 증식하여 콜로니를 형성하며 이는 쉽게 옮겨질 수 있다. 도말평판은 일반적으로 가장 유용한 평판법이다. 멸균한 백금이를 적당히 희석한 미생물현탁액에 넣은 뒤 굳은 한천배지 위에 일련의 평행하고 중복되지 않는 선을 그어 도말한다.

 

접종원은 반복되는 도말에서 점진적으로 희석되어 처음에 도말한 부위에서는 합쳐진 상태로 자란다 하더라도 뒤에 도말한 부위에서는 잘 분리된 콜로니들이 그어진 선을 따라서 자라게 된다. 주입평판에 의해서 분리가 가능하다. 단계적으로 희석한 접종원을 멸균한 페트리접시에 놓고 식었으나 액체상태인 한천배지와 혼합시킨 다음 응고시킨다. 단계적으로 콜로니가 한천 속에 묻혀서 자라게 된다. 평판법에 의한 혐기성세균의 분리는 특이한 물제를 야기시킨다. 원하는 미생물들이 산소에 노출되었을 때 빨리 죽지만 않는다면 평판배지는 일반적인 방법으로 준비하고 화학흡수제나 진공처리에 의해 산소가 제거된 밀폐용기내에서 배양하도록 한다.

 

산소에 더욱 민감한 혐기성 세균에 대해서는 희석진탕배양으로 알려진 변형된 주입평판법이 적합하다. 즉, 식혔으나 아직 녹아있는 한천배지가 들어 있는 시험관에 접종하여 섞어준 다음 전체의 1/10 정도를 두 번째 시험관에 옮겨준다. 그 다음 이것을 섞어 주고 접종원으로 사용하여 같은 방법으로 세번째 시험관에 옮겨준다. 6～10번 연속적으로 희석한 후 시험관에 파라핀이나 멸균한 석유젤리를 부어 빨리 냉각시키고 밀봉하여 한천에 공기의 접근을 방지한다. 진탕배양에서 콜로니는 고체한천의 깊은 곳에서 자라게 되며 따라서 옮기기가 힘들다.

 

세균을 옮기기 위해 바세린과 파라핀밑봉을 멸균한 침으로 제거한 후에 시험관벽과 한천 사이로 미세한 모세관을 통해 무산소가스를 주입시키면서 시험관에 담긴 한천을 멸균한 페트리접시로 빼낸다. 콜로니를 조사하고 옮겨주기 위해서는 멸균된 칼로 한천기둥을 원판으로 자른다. 많은 세균들은 순각적인 공기노출에 의해서도 죽게 되므로 이러한 절대혐기성 세균의 성공적인 배양을 위해서는 미량의 산소라 하더라도 항상 이를 제거하기 위한 특수한 방법이 요구된다. 산소가 완전히 제거된 상태에서 세균을 배양하기 위해서는 미량의 산소라 하더라도 항상 이를 제거하기 위한 특수한 방법이 요구된다.

 

산소가 완전히 제거된 상태에서 세균을 배양하기 위해 최근 사용되고 있는 2가지 중요한 기술은 회전시험관법과 혐기적 장갑상자법이다. 자연계의 혼합개체군으로부터 세균을 분리할 때 기술이 좋다면 많은 콜로니들이 서로 분리되어 자라는 평판이나 회전시험과 또는 희석진탕법 등의 방법을 사용하는 것이 가능하다.

 

이러한 콜로니들로부터 세균을 떠서 적당한 배지에 옮겨준다면 그것을 과연 순수배양이라 할 수 있을 것인가? 비록 때때로 이러한 방법으로 될 수 도 있지만 이렇게 분리한 것은 순수배양과는 거리가 멀다. 혼합된 콜로니를 형성할 수 있도록 배지 위에 함께 접종한 유사한 2개의 미생물들이 하나의 특정 콜로니를 형성하게 될 가능성도 있다. 더욱이 미생물들은 영양요구조건이 상당히 다양하므로 자연에 존재하는 모든 미생물들의 증식을 가능하게 하는 배지나 증식조건은 존재하지 않는다.

 

실제로 소수의 미생물들만이 어떤 주어진 배지에서 최초로 콜로니를 형성할 수 있을 것이다. 따라서 초기의 평판상에서 볼 수 있는 모든 콜로니들에는 한천 배지상에는 살아 있으나 눈으로 보일 정도의 증식을 할수 없는 수천개의 다름 종류의 미생물들이 존재할 수 있다. 그러므로 옮겨줄 때 이러한 미생물 중의 몇 종류가 같이 옮겨질 가능성이 높다. 순수배양을 할 때 초기의 평판에서 세균을 분리해서는 절대 안된다.

 

대신에 초기의 평판상에서 분리된 콜로니의 현탁액을 두 번째 평판에 다시 접종해야 한다. 만약 두 번째 평판에 나타난 콜로니들이 모두 동일하다면, 잘 분리된 콜로니 하나가 순수배양을 위해 사용될 수 있다. 선택적인 억제효과를 가지는 물질을 배지에 첨가시켜 주는 것이 자연계로부터 세균을 분리하는 데 도움을 줄때가 있다. 생물학적 특이성 때문에 몇 가지 항생물질들이 이용된다. 세균은 페니실린에 대한 감수성이 다양하므로, 최초의 미생물집단에서 페니실린은 민감한 세균의 증식을 억제하기 위하여 낮은 농도로 사용될 수 있다. 높은 농도의 페니실린은 원핵생물에 대해서는 일반적으로 독성을 나타내지만 진핵생물에 대해서는 독성을 나타내지 않는다. 따라서 세균에 오염되기 쉬운 원생동물, 곰팡이 및 진핵조류들을 분리하는 데 있어서 페니실린은 매우 유용한 물질이다.

 

반대로 원핵생물은 진핵 생물에 유용한 니스타틴과 같은 폴리엔 항생물질에 민감하지 못하다. 따라서 이런 종류의 항생물질을 분리용 배지에 첨가하면 곰팡이나 아메바에 의해 오염이 많이 된 세균을 분리하는 데 유리하다.

 

1.코흐평판배양법(Streak plate culture)

1) 실험 기구 및 시약

① 시험균 : E. coli와 S. macrescens를 3:1의 비율로 혼합하여 24-48 시간 배양한 균액과 E. coli와 Staph. aureus를 1:10의 비율로 혼합하여 24-48시간 배양한 균액

② trypticase soy agar 평판배지

③ 분젠버너, 백금루프, 95% 에탄올, 500ml 비이커, 도말용 유리봉, 펜

 

2) 시험 방법

① 백금루푸로 시험균을 따서 평판배지의 한 쪽 도말한다.

② 백금루푸를 분젠버너 불꽃으로 멸균시킨 후 최초 접종부위를 거쳐 평판의 다른 분위에 도말한다.

③ 재차 백금루푸를 불꽃으로 구운 후 두 번째 도말한 부위를 거쳐 평판의 다른 부위에 도말한다.

④ 동일한 방법으로 다시 평판의 나머지 부분에 도말한다.

⑤ 평판배지를 거꾸로 하여 24-72시간 배양한다.

⑥ 형성된 집락에 대해서는 그 특성을 정리하여 둔다.

2. 코흐평판배양법(Koch pour plate culture)

멸균한 무균작업대에 건열멸균한 페트리접시 3장을 넣는다. 한편 고체배지가 들어 있는 시험관 3개를 더운 물 냄비 속에서 굳지 않게 하고 집적배양한 시료와 함께 면전은 화염멸균을 하고 버너는 승홍수로 살균하여 함게 무균작업대에 넣는다. 멸균한 백금이로 시료에서 한 백금이를 제 1의 시험관배지에 넣어 잘 섞는다. 이 배지에서 다시 멸균한 백금이로 한 백금이를 제 2시험관배지에 넣어 섞고 또 멸균한 백금이로 한 백금이를 제 3의 배지에 넣는다.

 

이 3개의 시험관을 다시 잘 흔들어 미리 준비하였던 페트리 접시에 부어 냉각응고를 시키고 거꾸로 하여 배양기에 넣는다. 페트리 접시를 거꾸로 하는 것은 배양기 속에서 물방울이 페트리 접시의 위쪽에 떨어져서 오염되는 것을 막기 위한 것이다. 이 바업에 따르면 제 1, 제 2, 제 3으로 희석됨에 따라 현탁되는 균수가 적게 되고 그만큼 순수한 집락을 만들게 된다. 이상의 평판들은 배양기에서 세균은 1～3일, 곰팡이는 5～7일후에 집락을 만든다. 고립된 집락을 다른 배지에 이식한다. 검경 후 순수분리 되었다고 인정되면 사면배양 또는 천자배양을 하여 보존한다.

현미 해부법

이것은 많은 세포 중에서 원하는 것을 가려내는 방법으로 쓰인다. 짜이스사의 제품은 3차원으로 움직이는데 두폰브루네사의 제품은 한 개의 핸들이 기압작용으로 편리하게 움직인다. 앞의 각종방법에 의하여 얻은 순수분리 미생물은 순수배양을 하여 다음의 연구에 쓴다.

고체 배양법

1. 사면배양법(Slant culture)

사면배지의 제조법은 앞에서 설명하였다. 이 배지에 분리한 미생물을 백금선을 사용하여 한천표면의 아래서 위로 선을 긋는다. 이때 한천표면에 구멍이 파이지 않도록 주의한다. 이것을 적온의 배양기 속에 넣어 1～3일이 되면 집락이 발생한다.

 

2. 천자배양법(Stab culture)

혐기성미생물의 보존에도 많이 사용된다. 균을 백금선에 채취한 후 이것을 응고한 한천배지의 위에서 아래로 수직으로 찌른 후 가만히 빼서 적온의 배양기에 넣는다. 가스를 발생하면 구열이 생기고 젤라틴을 사용하여 균의 용해성의 유무를 조사한다.

액체 배지에 순수 배양의 분리

일반적으로 대다수의 세균이나 곰팡이는 고체배지에서 잘 자랄수 있으므로 이들을 분리하는 데는 평판법이 적당하다. 그러나 아직도 보다 더 큰 몇가지 세균들은 고체배지에서 성공적으로 배양하지 못하였으며, 많은 원생동물과 조류는 액체배지에서만 배양이 가능하다. 비록 최근에 이르러서 비루스의 분리를 위한 평판법이 많이 밝혀지고 있지만 이들의 대부분은 액체배지를 이용하여 쉽게 분리될 수 있다. 물론 비루스는 절대세포내 기생체이므로 결코 순수배양을 얻을 수 없으며, 특정 비루스와 숙주생불로 구성된 이원배양이 이러한 미생물군을 분리하는 데 사용된다.

 

액체배지에서 가장 간단한 분리법은 희석법이다. 접종원은 멸균한 배지로 연속적으로 희석되며, 배지를 함유한 많은 수의 시험관에는 동량의 연속된 희석액을 접종한다. 이렇게 하는 이유는 일련의 시험관에 미생물현탁액을 희석시켜 접종함으로써 하나의 세포라도 그것이 시험관에 들어갈 확률을 작게 하기 위해서이다. 그러나 희석법은 단점이 하나 있다. 혼합된 미생물개체군에서 수적으로 우세한 균주를 분리하는 데에만 이용할 수 있다는 것이다. 고체배지에서 자랄 수 없는 큰 미생물들을 분리하는 데에는 이용할 수 없는데, 그 이유는 자연계에서 일반적으로 이러한 미생물들은 세균보다 수적으로 미약하기 때문이다. 따라서 희석법의 이용은 한정되어 있다.

 

평판법이나 희석법 모두가 이용되지 못할때는 혼합균주로부터 단일세포나 균주를 현미경하에서 분리하는 단일세포 분리라는 방법을 사용한다. 단일세포분리의 기술적인 어려움은 분리하고자 하는 생물체의 크기와 관련이 있다. 즉, 조류나 원생동물과 같은 대형세포를 분리하기는 비교적 쉽지만 세균을 분리하기는 더욱 어렵다. 큰 미생물의 분리는 미세한 모세관 피펫내에 하나의 개체를 잡은후 비교적 큰 부피의 멸균된 배지에서 수차례에 걸쳐 씻어내어 작은 크기의 미생물에 의한 오염을 방지한다.

 

해부현미경과 같이 비교적 낮은 배율하에서 직접 현미경관찰에 의해 성공적인 조작을 할 수 있다. 만일 분리하고자 하는 생물이 너무 작아 100배의 배율로도 관찰할 수가 없을 때는 모세관이나 피펫을 적용할 수 없다. 그것은 고배율에서 직접 모세관피펫을 조작하기가 어렵기 때문이다. 이 경우 현미해부기로 알려진 기P장치와 아주 미세한 유리로 특별히 준비된 조작기구가 함께 사용된다.

 

1. 정치 배양법(Static culture)

시험관에 멸균된 액체배지를 10ml 정도 넣고 한 백금이의 미생물을 이식하여 적온의 배양기에서 배양한다. 이 방법으로 증식의 유무, 균개, 피막, 침전물 형성의 유무, 가스발생, 생산물검출반응, 배양액 혼탁도 등을 관찰한다.

 

2. 액체내 통기 배양법

산화발효를 시킬 때, 산화세균, 효모 등의 균체를 다량으로 수확할 목적으로 배양할 때에 통기배양법을 쓴다. 간단히 통기뱡을 할 때에는 면여관을 써서 흡인 또는 압입하여 공기를 구균공기로 하여 배양액을 통과시킨다.

 

3. 진탕배양법(Shaking culture)

각종 배양병에 배지를 넣고이식 후 배양기에 설치된 진탕기에 얹어 배양한다. 진탕기에는 왕복진탕기등이 보통이다. 주의할 점은 진탕 중 면전에 배지가 묻으면 오염의 원인이 되므로 묻지 않도록 하여야 한다. 또 면전을 너무 단단하게 하면 안되고 접종 량을 다량으로 하여야 한다.

 

4. 통기 교반 액침 배양법(Aerated submerged cultrue)

발효수조를 사용한다. 그 구조에 따라

1) 멸균준비를 한다.

2) 멸균한다.

3) 멸균후 면여관을 닫고 균을 이식한다.

혐기성 세균의 분리 및 배양법

1. 중층법에 희한 분리 및 배양

육즙한천배지 및 포도당 육즙한천배지 각 3개를 가열 용해하여 평판배양과 함께 세균을 제 1, 제 2, 제 3시험관에 희석한다. 따로 부리관 2개를 세척하여 한 끝은 고무관 한 끝은 면전을 끼어 고압증기 멸균기에서 121℃, 20분간 멸균한다. 이 관의 고무마개를 아래로 하여 면전을 빼고 먼저 세균수가 가장 적은 제 3희석 시험관배지를 주입하고 시험관 외부를 냉수로 냉각하고, 다음에 제 2시험관배지를 부어 냉각, 끝으로 제 1시험관 배지를 주입한다.

 

조작은 무균작업대 속에서 빨리 하지 않으면 녹은 배지가 굳어 버린다. 접종이 끝나면 적온의 배양기에서 배양한다. 배양후의 결과는 상층부일수록 집락수가 많은나 표면에는 공기가 있기 때문에 생육하지 못한다. 2종의 배지를 쓴것은 만일 가스가 발생하면 포도당 함유배지에서 구열이 생기므로 곧 알 수 있다. 증식한 집락은 멸균배지로 옮긴후 멸균메스로 잘라 백금이로 액체 배지에 이식한다.

 

2. 진공배양법에 의한 혐기성균의 분리 및 배양

1) 진공건조기법

진공건조기속에 배양할 것을 넣고 공기를 몰아 내고, 건조기상태로 배양기에 넣는다.

 

2) 간이법

단독으로 보존할 목적으로 간단한 것이 쓰인다. 즉 목을 길게 만든 시험관에 배지를 넣고 진공펌프로 공기를 뽑고 녹여서 밀봉하여 배양한다.

 

통성 혐기성균 또는 미호가성 균의 배양

1. 천자배양법

각 세균의 생장형이 특별히 다르기 때문에 통성혐기성균 또는 미호기성균의 분리 및 저온 저장용으로 이용한다.

 

이원 배양

분리의 목적은 일반적으로 순수배양을 얻기 위한 것이다. 그러나 이것을 얻을 수 없거나 실현이 어려운 특수한 경우도 있다. 이러한 상황 하에서는 단 2종류의 미생물만을 함유하는 이원배양의 형태로 하는 수밖에 없다. 이미 언급한 바와 같이 이원배양은 원칙적으로 비루스를 배양하는 유일한 방법이다. 왜냐하면 비루스는 도두 세포성 생물들의 절대세포내 기생체이기 때문이다. 절대세포내 기생체는 또한 몇 몇 세포성 미생물군의 특징이기도 하다. 이 모든 경우에 이원배양은 연구실에서 할 수 있는 가장 좋은 배양방법이 된다. 장연상태에서 조그마한 미생물을 잡아먹는 다수의 원생동물들은 작은 미생물먹이와 연관된 이원배양으로 연구실에서 쉽게 배양할 수 있다. 예컨대 섬모충류, 아메바 및 점균류등에서 찾아볼 수 있다.

 

이 경우에는 연관성은 절대적인 것이 못된다. 왜냐하면 이 군에속하는 몇몇 대표적인 종에 관한 영양학적 연구에서 이들이 순수배양으로 자랄 수 있다는 것을 나타내기 때문이다. 그러나 때때로 원생동물의 영양요구성은 너무나 복잡하여 순수배양의 유지를 위한 배지의 조제는 어렵고 또한 힘들다. 통상의 유지목적 그리고 많은 실험목적에 이원배양은 적절하다. 이원배양의 확립은 2가지 측면에서 이루어진다.

 

첫째로 먹이생물의 순수배양을 확립하는 것이 필요하다. 이것이 일단 성취되면, 포직자 또는 기생체는 다양한 방법중 어느 하나에 의해 분리될 수 있고 먹이생물의 순수배양에 도입할 수 있다. 배지는 포식자 또는 기생체의 요구를 충족시키기 위해 먹이생물의 충분한 증식을 허용하여야 하지만, 먹이 생물이 포직자나 기생체보다 더욱 많아지거나 해로운 대사산물을 생산 할 만틈 지나치게 많아져서도 안된다.

 

참고 문헌

1. 최신미생물학, 아카데미서적, 배무영, 1993, pp34 - 37.

2. 표준미생물학, 아카데미서적, 김동한, 2000, pp67 - 69.

3. 미생물학 실험교재 편찬위원회, 미생물학 실험, 월드 사이언스, 2001, pp27 - 35.