[미생물학실험]Mini-Preps of plasmid DNA

실험 목적

Mini prep의 원리를 이용하여 Plasmid DNA를 분리해낼 수 있다.

 

실험 이론 및 원리

1. Mini-Prep.

E.Coli세포에서 Plasmid DNA 와 Chromosome DNA를 분리하여 Plasmid DNA를 추출하는 원리.

단도직입적으로 말해서, Chromosome DNA와 Plasmid DNA의 구조적 차이라 할 수 있다.실험 과정에서, Solution Ⅰ, Ⅱ로 인해 플라스미드와 chromosome DNA가 세포내에서 외부로 방출된다. 이 때 NaOH는 DNA를 single strand로 denature시킨다.

 

denature 과정에서, Chromosome DNA는 쉽게 single strand로 풀어지는 반면, plasmid DNA는 supercoil형태이기 때문에, alkaline condition에 대한 저항성이 있어서 쉽게 풀어지지 않는다. 따라서, plasmid DNA가 alkaline condition에 저항하여 intact form으로 solution 상에 녹아있는 반면에, Chromosome DNA는 denature되어 single strand로 풀린다.

 

그 후 Neutralization buffer를 첨가해 중성 환경으로 복원시키면 linearized 된 chromosome DNA는 다시 dsDNA로 돌아가기 힘들게 되고 (너무 길게 엉겨있어서 제 짝을 찾기가 만만치 않다. 쉽게 말해 부피가 커서 복원이 힘들다.) single strand DNA는 potassium acetate를 넣는 순간 불용해성을 띄고 침전되어버린다. 따라서 plasmid DNA만 추출이 가능하다.

 

주의할 점은, supercoil이 alkaline condition 에 대한 저항성을 가지나, 지속적으로 노출되었을 경우, supercoil DNA 역시 denature 된다는 점이다. plasmid 정제 프로토콜에 보면, solution 2를 넣고 5분이상 incubation하지 말라는 주의가 항상 있는데, 이는 plasmid DNA가 alkaline condition에 오래 노출되면 supercoil 또한 denature되기 때문이다.

 

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

ice, 원심분리기, vortex, electrophoractor, eppendorf tube, pipet

 

2. 실험 시약

solution Ⅰ, solution Ⅱ, solution Ⅲ, RNase, phenol, chloroform, ethanol, 멸균된 H2O

※ solution Ⅰ, solution Ⅱ, solution Ⅲ

Solution Ⅰ	Solution Ⅱ	Solution Ⅲ
50mM glucose 25mM Tris HCl (pH 8.0) 10mM EDTA (pH 8.0) 0.2g Lysozyme	0.2N NaOH 1％ SDS	5M Potassium acetate acetic acid

 

실험 방법

1. 실험 과정

① Overnight culture in 2 ㎖ LB (+Amp)

② Spin out 1.5㎖ of culture broth in eppendorf tube 14K, 3min

③ Resuspend pellet in 100㎕ of sol'n Ⅰ: resuspend by pepetting up and down Incubate for 5 min at room temperature

④ Add 200㎕ of sol'n Ⅱ : invert 5 times. Incubate in ice for 5 min

⑤ Add 150㎕ of sol'n Ⅲ(prechilled) : invert. Incubate in ice for 5 min

⑥ Spin at 14K for 5 min at 4℃ : remove super and save. Be careful not to have any shite pellet. If any, repeat spining

⑦ Add 2㎕ of RNase, Incubate at RT 15 min

⑧ Extract 1 time with 200㎕ of phenol + 200㎕ of chloroform

⑨ Spin at 14K for 5min at 4℃, then extract with chloroform (same volume : 400～450㎕)

⑩ Spin at 14K for 5min at 4℃

⑪ Add 700㎕ of 100％ Ethanol and let stand at RT for 10 min

⑫ Spin at 14K at 4℃ for 3min

⑬ Wash pellet with 400㎕ of 70% Ethanol

⑭ Spin at 14K at 4℃ for 3 min

⑮ Dry

⑯ Resuspend in 40～50㎕ of d'H2O

⑰ Electrophoresis

 

실험 결과

1. 결과 분석

① DNA band가 0～2개로 나타났다. 1개가 제일 많이 관찰되었고, 그 다음은 2개,0개 순이다.

② 먼저 전기영동장치에 시료를 넣었던 조에서 1개의 DNA band가 많이 관찰되었고, 전기영동장치 작동 바로 전에 시료를 넣은 조에서는 2개의 DNA band가 많이 관찰되었다.

③ DNA 농도가 높은 시료는 더 밝고 선명하게 측정되었다.

 

토의 사항

1. 실험 고찰

① 예상대로라면 3개(supercoiled form, nicked circular form, circular form)의 DNA band가 관찰되어야 한다. 하지만 0～2개가 관찰되었다. Plasmid DNA가 분명히 있었는데도 이런 결과가 나왔다면, 실험에 익숙하지 않아서 실험 중에 오차를 낼만한 실수를 하였기 때문에 예상과 결과의 차이가 생긴 것이다. 실험 중에 실수를 한 경우는 염색이 제대로 안되었거나, pepetting up and down할 때 거품이 많이 생기게 하거나, DNA를 제대로 남기지 못한 점 등을 생각할 수 있다.

② 실험별로 DNA band 수가 다르게 측정되었다. 전기영동장치에 시료를 넣을 때, 조별로 시간 차이가 있어서 DNA의 band수가 다르게 측정이 된 것 같다.

 

참고 문헌

1. Brock 의 미생물학 12판. 라이프사이언스