[일반생물학실험]Plasmid DNA isolation from bacterial cell : miniprep

실험 방법

1) 실험 과정

① 미리 배양한 대장균 (E.coli) 세포 1.9㎖을 2㎖ tube에 넣고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 후 상등액은 버린다.

② 남은 용액은 Micro pipette으로 제거하고 Cell 덩어리를 얻는다. 이때 배지 성분이 남아있지 않도록 pipette으로 배지를 완전히 제거한다.

③ Cell이 들어있는 2㎖ tube에 S1 solution 250㎕을 넣고 pipetting한다.

④ S2 solution 250㎕을 넣고 조심스럽게 3~4번 inverting을하고 2분간 방치한다.

⑤ S3 solution 350㎕ 조심스럽게 inverting 한다.

⑥ 10분간 원심분리 한 후 plasmid purification tube에 상등액을 붓는다. 이때 pipette을 사용하지 않는다.

⑦ 1분간 원심분리 한 후 column filter로 걸러진 under tube의 solution은 버린다.

⑧ 750㎕ PW buffer를 plasmid purification tube에 넣고 1분간 원심분리 한다.

⑨ under tube의 solution을 버리고 한 번 더 2분간 원심분리 한다.

⑩ under tube를 새 tube로 교체하고 30㎕ EB buffe를 넣는다.

⑪ 1분간 원심분리 한 후 tube에 모아진 plasmid DNA를 ATGC ladder와 섞어 염색한다.

⑫ Agarose gel 전기영동장치를 이용해 20분간 전기영동한다.

⑬ UV transilluminator로 결과를 확인한다.(실험에서 원심분리 속도는 13,000rpm, 사용한 tube는 2㎖이다.)

 

실험 결과

1. 결과 분석

우선 ①의 과정을 통해 무거운 E.coli Cell들이 뭉쳐 덩어리가 된다. 이때 ③의 과정에서 S1 solution (resuspension buffer)을 넣어 세포벽을 파괴한다. S1 solution의 구성물질인 EDTA는 세포벽에 작용해 세포벽을 적당히 깨는 역할을 하고, Tris buffer는 pH를 일정하게 맞춰주는 역할을 한다.

④의 과정에서는 S2 solution (lysis buffer)은 세포벽을 완전히 파괴하는 역할을 한다. S2 solution의 구성물질인 SDS는 계면활성제로 인지질로 구성된 세포막을 제거해주는 역할을 하고, NaOH는 염색체 DNA를 변성시켜 작게 잘라준다. 이때 반응시간은 5분을 넘을 경우 염색체 DNA가 너무 작게 조각나 plasmid DNA와 섞이기 때문에 넘지 않도록 주의해야 한다. 실험의 경우 2분간 반응시간을 두고 ⑤의 과정을 진행했다.

⑤에서는 S3 solution (neutralization buffer)을 넣는데 순수한 물을 pH7으로 맞춰준 용액과 같다. 이 과정을 통해 용액을 중성화 시킨다. 이때 염색체와 plasmid DNA가 복원되는데 염색체의 경우 크기가 크기 때문에 원래의 크기로 복원되지 않고 엉키게 된다. 이 과정에서 염색체와 plasmid DNA가 엉켜 용액이 뿌옇게 흐려진다.(Figure1.참고)

⑥의 과정에서는 원심분리 후 용액을 옮길 때 pipette를 이용할 경우 tube에 붙어있는 침전물인 염색체로 인해서 막힐 가능성이 있으므로 기구를 사용하지 않고 붓는다. 이는 용액의 상등액에 plasmid DNA가 있고, 침전물은 염색체이기 때문이다.

⑦의 과정에서 column filter로 단백질이 걸러지며 ⑧~⑨에서 PW buffer (washing buffer)를 넣어 남은 단백질을 걸러낸다. 또한 PW buffer의 에탄올이 전기영동 시 이온으로 작용해 양극으로 이동한다.

⑩에서는 EB buffer (tris buffer)를 넣어 ⑪ 원심분리를 하면 plasmid DNA는 column에서 tube로 옮겨진다. 이 과정을 거쳐 얻은 plasmid를 ATGC ladder 염색약과 섞는다.(Figure2&3.참고) 이때 염색약은 DNA를 눈에 보이게 해주며 밀도가 높아 gel의 틈에 안정적으로 들어가게 도와준다. 염색된 DNA를 gel 틈에 넣고 20분간 전기영동을 한 후 (Figure4.참고) 결과를 UV transilluminator로 확인한다.(Figure5.참고)Figure 1~6. (상단에서 왼쪽에서 오른쪽 순서로)

 

2. 결론

UV transilluminator로 확인한 결과 Band가 나타났다. 이로 인해 plasmid DNA가 분리된 것을 알 수 있다.

토의 사항

1. 실험 고찰

실험결과 plasmid DNA를 분리해 Band가 나타났지만 생각보다 작은 양의 결과가 나왔다. 실험에서 사용한 Agarose gel 전기영동장치의 원리는 DNA의 인산기가 (-)전하를 띠어 (+)로 이동하는데 이때 겔의 그물 구조를 빠져나가기 위해서 DNA의 크기가 작을수록 더 잘 빠져나간다. 즉 실험의 결과상 실험에서 얻어낸 DNA가 크기가 작지 않았거나 혹은 DNA의 농도가 작았기 때문에 실험 상 Band가 연하게 나온 것이다.

우선 plasmid DNA의 크기가 작지 않았을 경우인데 이 경우는 plasmid DNA의 크기 자체가 작은 것을 감안하면 타당하지 않다. 하지만 실험 과정에서 획득한 plasmid DNA를 염색약과 섞어 agarose gel과 0.5XTAE buffer에 넣을 때 pipette로 넣는 과정에서 앞의 용액과 섞여 농도가 낮아 졌을 수도 있다. 다른 이유로 실험상에서 큰 실수는 없었지만 PW buffer를 넣는 과정에서 투여량에 조절을 실패해 PW buffer가 plasmid를 제외한 다른 단백질 등을 완벽히 없애지 못하여 plasmid DNA의 농도가 작게 나온 경우를 생각해 볼 수 있다.

혹은 실험에서 사용한 단위인 ㎕이 굉장히 미세한 단위이므로 Micro pipette를 사용하는 과정에서의 약간의 오차가 실험의 결과에 크게 영향을 끼쳤을 경우도 있다. 위의 경우로 실험에서 Band가 연하게 나왔을 것으로 추측할 수 있었다. 본 실험에서는 소량의 plasmid DNA를 분리해내는 실험으로 실험을 통해 각각의 buffer가 사용되는 이유를 알 수 있었고 전기영동 장치로 얻어진 DNA를 확인할 수 있었다.