[보건환경미생물학실험]Construction & transformation of the expression vector containing the amplified gene

실험 목적

insert DNA와 vector DNA를 결합시키고, 그것을 해당 미생물에 도입하고자 한다.

실험 이론 및 원리

1. Cloning vector

DNA를 인위적으로 삽입하여 미생물에서 증폭, 유지하기 위한 매개체이다. 예를 들어, pBR322, pSC101, pBR328 등이다. 이 실험에 사용하고자 하는 것은 pBGS18이다.

 

2. Expression vector

vector에 삽입된 외래 유전자가 host 내에서 발현되도록 만들어진 cloning vector이다. 따라서 특정 유전자를 숙주의 유전 발현체계에서 발현시키도록, SD서열, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site) 등이 삽입되어 있다.

 

3. Shuttlecock vector

복제 양식이 다른 두 종류 세포의 어느 곳에서도 복제가능한 복합 플라스미드이다. conjugated plasmid를 지칭하며, mob(mobilization) gene가 plasmid 내부에 있기 때문이 pili를 통해서, plasmid의 이동이 가능하다.

 

4. Ligation process

1) ligase : 에너지를 이용해 이중사슬 DNA의 한 사슬에 있는 nick에 대한 봉합 반응을 촉매하는 효소이다.

① T4 ligase : ATP를 에너지로 요구하며, blunt end ligation에 작용하는 힘이 강해 많이 사용되고 있다.

② E. coli ligase : NAD+를 에너지로 요구하며, cohensive(sticky) end ligation에만 작용한다.

 

2) buffer : 10× ligase Buffer

① 0.5M Tris-Cl(pH 7.8)

② 0.1M MgCl2 : phosphodiester bonding T4 DNA ligase의 cofactor로 작용한다.

③ 0.2M DTT : dithiothreitol의 약칭으로, 효소의 안정화와 불활성 방지를 한다. 부정확 시 제한 효소의 활성이 저하되거나 불균일 절단이 일어난다.

④ 10mM ATP : T4 ligase의 energy로서, T4 ligase를 활성화시킨다.

 

3) ratio : insert DNA : vector DNA는 3M : 1M로 넣어 준다.

 

5. TSS transformation process

Transformation & Storage Solution의 약칭이다. DNA를 삽입하도록 처리한 세포로서, 대부분의 대장균이 유전자 도입 때 사용되는 균체인 competent cell(수용성 세포)을 만들기 위해 넣는 용액이다. 이것을 넣으면, 세포분열 초기 상태로 만들고, 시약처리를 해서 외부 DNA(plasmid) 흡수를 최대로 하게 만든다. 기본적으로 CaCl2를 포함해 buffer로 구성되는 용액이며, competent cell을 만드는 방식에 따라 buffer의 조성이 달라진다. competent cell은 1× TSS에 넣어 최종적으로 -70℃에 보관한 뒤 녹여 사용하는 것이 지배적인 방법이다. 간편하게 칼슘용액으로 처리해서 competent cell을 만드는 방법과 효율적으로 루비듐용액으로 처리해서 cometent cell을 만드는 방법도 있다.

1) Tryptone 1g : pepetone처럼 아미노산을 공급하기 위해 넣는다.

2) Yeast Extract 0.5g : 효모추출물로 영양소를 공급하기 위해 넣는다.

3) NaCl 1g : 삼투압을 조절하기 위해 넣는다.

4) PEG 3350 10g

PolyEthyleneGlycol의 약칭으로, 합성계면활성제이다. 형질전환 효율을 100배 이상 증가시킨다. 이유는 명확히 밝혀지지 않았다. 세포융합 때도 쓰이는 중합체인데, 이 때는 세포와 세포, 세포와 리보솜 등을 원심침강으로 밀착시키고, 고농도의 PEG일 경우에는 막융합이 된다고 한다. 이것은 자유수의 소실에 따른 소수적 상호작용 또는 불순물의 영향이라고 추측한다. 또한, 어떤 가설에 의하면 세포막단백질을 몰리게 해서 세포막의 노출을 극대화시켜, 세포융합 기회를 확대시킨다고 한다. 단백질, 핵산분리를 위한 수용액 2층계의 구성성분이기도 하다. 고분자화합물이며, 안정화제인 이 물질은 점성이 높아 반응성을 높이고, DNA의 침전율을 높인다. 따라서 침전과 점성 등으로 인해서 plasmid가 competent cell에 삽입되기 쉽게 작용하는 것으로 추측한다.

5) DMSO 5㎕ : 동결을 시키기 위해 사용하는 물질이다. 영하로 내려가서 물이 얼 때, 수소결합을 방해하고, ice formation에 이상이 생기게 해, 얼음이 감소할 뿐만 아니라, 얼음 결정 구조가 이상해서 세포막에 손상을 입히지 못한다. 즉, 동결 때 세포충격을 완화시키는 물질이다.

 

6. LB(2000㎖) solution

Luria & Bertani나 Luria broth의 약자이다. 미생물을 배양 시에 사용하는 것으로서, 세균의 생장배지이다. 37℃ overnight incubation이 필요하다.

Yeast Extract 1g, Tryptone 1g, NaCl 1g

Agar 3g : 미생물이 분해할 수 없으며, agar 위에 군집을 형성하도록 하기 위해서 넣는다.

 

7. MgCl2 Buffer

효소의 nucleotide cofactor로, 조효소로 작용하는 뉴클레오티드 유도체이기도 하다. 이 물질을 넣는 이유는 전리가 된 칼슘 이온은 세포막 밖에 있고 염소 이온은 안에 있어서, 음전하 charge가 된 염소이온이 물과 함께 세포 내로 진입해서 세가 부풀어 오르는 것과 함께, DNA가 음전하 charge이기 때문에 도입할 유전자도 음전하 charge라서 서로 밀어내는 것을, 밖의 마그네슘 이온과 칼슘 이온이 세포막을 coating해서 접근성을 높이는 거라 추측한다. 또는 DMSO와 같은 역할이라 예상하며, 마그네슘 대신 칼슘이 쓰이기도 한다. 정확한 메카니즘은 증명이 안 되었다.

 

8. electroporation

전기천공법이며, 세포를 DNA용액에 현탁하여 직류고전압의 펄스를 통과시키면 세포내에 DNA가 도입되는 것을 이용한 유전자 도입법이다. 전기에 의해 세포막에 구멍이 뚫리고 동시에 DNA 분자가 전기영동의 작용으로 세포내로 도입된다는 것이 가설이며, 유전자 도입 효율이 아주 높다.

 

9. selection medium

선택배지이며, 원하는 표현을 가진 미생물의 조환형이나 돌연변이체만 생육할 수 있도록 영양소를 적절히 넣은 배지이다. 이 실험에서는 LB 배지에 카나마이신과 X-gal을 혼합하여 넣는다.

 

10. 형질전환에 사용되는 균은 E. coli BL21(자연형)에서 LonD라는 강한 단백질분해효소 생산을 결여시킨 균이다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 재료

micropipette, 무균 tip, tube, heater, 냉장고

ddH2O, pBGS18 plasmid, T4 ligase Buffer(×10), T4 DNA ligase

실험 방법

1. ligation

※ heating 75℃에서 heating 20분간하여 제한 효소 기능상실을 한 sample을 이용.

1) 각 ddH2O 4㎕씩 넣는다.

2) 각 튜브에 T4 ligase Buffer(×10) 2㎕씩 넣는다.

3) pBGS18 plasmid 3㎕씩 넣는다.

4) 각 튜브에 Pseudomonas HK-6 sample을 각 10㎕씩 넣는다.

5) 각 튜브에 T4 DNA ligase 1㎕씩 넣는다.

6) PCR 기구에 넣고 16℃ 14시간으로 하고 4℃로 정지 및 보관한다.

insert DNA끼리, vector DNA끼리 합치지 않게 하고, 점착성 말단(cohensive end)이 떨어지기 쉬워, 목표 DNA 외의 DNA와는 잘 안 붙고, 목표 DNA와 붙었다면 잘 안 떨어지게 하기 위해서, 열을 낮춰 DNA들의 움직임을 약하게 만든다.

실험 결과 및 토의

1. 결과 예측

단백질 발현을 통해 그 결과가 나올 것이며, 이 때까지 아무 문제 없었고 발현 벡터가 잘 들어갔다면, 흰색 군집이 배지 위에 왕성하게 있을 것이다. 하지만 발현벡터가 접합이 잘 안되어 있다면, 카나마이신에 의해 죽어 군집이 많지가 않거나, 청색의 군집이 있을 것이다.

 

2. 실험 고찰

16℃에 넣으면 분명 ligase의 반응과 DNA의 움직임이 느려져서, 천천히 작업이 되지 않을까 한다. 하지만 T4는 바이러스에서 왔고, 바이러스는 세균보다 낮은 온도에서도 잘 적응한다고 하니깐, 오히려 ligase가 DNA보다 운동성이 늘어 점착성 말단에 대해 좋은 점착을 하는 것일지도 모른다. insert DNA와 vector DNA가 잘 붙었다고 하면 분명한 환형을 구성할 것이다. 생각했던 것처럼, 형질전환을 통한 단백질 발현을 시켜야 ligation의 결과를 알 수 있을 것 같다.