[미생물실험]에탄올 침전법(Ethanol Precipitation)

실험 목적

PCR로 원하는 DNA를 증폭한 후에 Ethanol을 이용하여 DNA만을 추출해 낼 수 있다.

실험 이론 및 원리

1. DNA Precipitation

PCR 생산물을 정제할 때 PCR 반응에 사용한 올리고 DNA 프라이머 및 기질 dNTP를 완전히 제거하지 않으면 안 된다. 왜냐하면 dNTP는 본래의 sequencer반응을 저해하기 때문이다. DNA는 적당한 salt(염) 농도와 적당한 alcohol 농도 하에서 침전된다. DNA 침전에 쓰이는 조건들은 다음과 같다.

 

Ethanol : 2～2.5 volume

sodium acetate(pH 5.2) : commonly used

sodium chloride : DNA containing SDS

ammonium acetate : triphosphate removal

inhibits T4 polynucleotide kinase and TdT

lithium chloride : RNA precipitation, very soluble in ethanol

inhibits reverse transcription

Isopropyl alcohol : 2～2.5 volume

 

일반적으로 DNA를 침전시켜 농축시킬 때는 위와 같은 alcohol 침전법을 많이 사용한다. 주로 ethanol이 많이 쓰이며, 알콜 침전시에는 monovalent salt ion(sodium이나 potassium 등)이 필요 한데, 위와 같이 여러 가지를 쓸 수 있으며 목적에 따라서 필요한 것을 골라서 쓸 수 있다. 예를 들어 전 단계까지 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 쓴 경우는 용액에 SDS가 들어 있으므로 sodium chloride(NaCl)을 salt로 쓰는 것이 좋다. 또한 ammonium acetate는 deoxyribonucleoside triphosphate(dNTPs)의 침전을 막는다. 

그리고 reverse transcriptase, DNA polymerase, terminal transferase catalyed reaction의 산물로부터 unreactive triphosphate를 제거하기에 유용하다. 전형적으로 이 과정의 침전은 약 99%의 dNTPs 를 제거할 수 있고 90% 이상의 DNA를 얻을 수 있다. 그러나 DNA가 phosphorylated 또는 tailed 되어있다면 ammonium acetate는 사용되어서는 안 된다. 왜냐하면 이 과정에서 필요한 enzyme을 ammonium ion이 방해하기 때문이다. 일반적으로는 ethanol과 sodium acetate의 조합을 가장 많이 쓴다.

 

2. Ethanol/Sodium Acetate Precipitation

Salt(염)의 존재 하에서 -20°C 이하에서 ethanol로 침전시키는 방법을 ethanol/sodium acetate precipitation라고 한다. 싸고 빠르다는 장점이 있지만 unincorporated dye-labeled terminator가 적게 제거되는 단점이 있다. 100%, 95%, 70% ethanol은 -20℃에서 냉동 보관해야 DNA가 침전이 잘 된다. Ethanol은 품질 이 좋은 Merck사의 제품을 쓰는 것이 좋다. 이 ethanol은 absolute ethanol이라 하며, -20℃에 서 보관해야 한다. Sodium acetate 용액은 pH 5.2를 많이 써 왔는데, 최근에는 이보다 높은 것을 사용하기도 한다.

1) 농도에 따른 precipitation 방법

① 농도가 낮을 때

DNA 용액에 -20℃의 ethanol과 sodium acetate(초산나트륨, monovalent cation(Na+))을 첨 가해서 DNA를 침전시킨다. ethanol을 첨가하면 물은 극성을 적게 띠게 된다. 따라서 DNA는 극성분자이므로 물을 피하게 되고, Na+는 DNA의 - charge를 상쇄해서 뭉쳐지기 때문에 침 전된다. 원심분리기(centrifugation)를 이용하여 침전물을 모은다.

 

② 농도가 높을 때

DNA 수용액에 ethanol을 첨가하여 DNA 수용액 위에 층을 만든다. 그 후, 뭉친 DNA층을 유리막대(glass rod)를 이용해서 spooling을 한다. 이 때, DNA fibre가 유리막대를 따라 올라 오게 된다.

 

2) Centrifugation(원심분리기)

Centrifugation은 용액의 양과 DNA의 존재량에 따라 결정된다. 적은 양(1㎖나 그 이하의 원래 용액에 DNA가 최소한 1/10㎖가 포함)일 경우에는 -70℃에 서 15분간 centrifugation을 하여 침전이 생성될 시에는 80% 이상의 회수가 가능하다. 많은 양(15～30㎖)일 경우에는 glass corex tube를 사용하여 허용 온도(-70℃)에서 부피에 의존하여 시간을 증가시킨다(30㎖ 용액당 최소한 30분간). 이것을 무시하면 -20℃에서 하룻밤을 침전시켜도 매우 낮은 농도의 DNA가 침전된다.

 

3) 보관

TE buffer(pH 8.0) 4℃에서 DNA를 가장 잘 저장 할 수 있다. TE buffer(pH 8.0)는 Tris-HCl 용액이 10mM, Na2EDTA(pH 8)용액이 0.1 또는 1mM로 되어 있는 용액이다. DNA 는 이름 그대로 산(acid)이기 때문에 수용액에 있으면 조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상되므 로, 위와 같이 tris buffer를 넣어준다. 또한 DNA를 변형시키는 효소들은 magnesium과 같은 2가 이온을 필요로 하므로 EDTA를 조금 넣어주면 이런 효소들로부터 DNA를 보호할 수 있 다. 만약 5년 이상 방치하기 위해서는 DNA를 -70℃에서 얼리고 중간에 온도 변화에 주의하 도록 하며, 다른 방법으로 4℃에서 CsCl에 녹여 보관하는 방법이 있다.

 

4) DNA를 ethanol로 침전시키는 이유

① 에탄올로 침전시키기 전까지의 용액에는 단백질이나, 다른 세포의 불순물을 제거하기 위해 서 사용된 약품들이 남아있을 가능성이 있다. 따라서 이런 용액을 실험에 직접 사용하면 그 반응성이 매우 떨어지기 때문에 에탄올로 침전시켜서 그런 약품을 제거한 후에 실험에 사용 하는 것이다.

 

② DNA의 농도가 작을 경우에는 이것을 실험에 원하는 용도로 쓰기 위해서 농도를 높일 필 요가 있고, 보관을 하기 위해서도 그렇게 하는 것이 나중에 사용하기 편리하다(농도를 높이는 것이 농도를 낮추는 것보다 귀찮다). 따라서 에탄올로 침전시켜 고농축의 DNA를 얻는 것 이다.

 

③ 에탄올 침전 과정에서 얻은 DNA는 같은 핵산인 RNA가 포함되어 있지 않아 그만큼 더 순수하다. 이것은 에탄올 침전 후 거기서 DNA를 얻는 과정 중에 자동적으로 RNA(작은 단편 으로 잘려진)는 제거되기 때문이다.

실험 기구 및 시약

1. 실험 기구

1) micro pipet(tip), plastic microcentrifuge tube(1.5㎖)

2) microcentrifuge, vortex

3) vacuum desiccator(진공 데시케이터), lyophilizer(냉각건조기)

 

2. 실험 시약

1) PCR 후의 DNA sample 20㎕, 3M sodium acetate 2㎕

2) 95% ethanol 40㎕(또는 100% ethanol)(-20℃)

3) 70% ethanol 250㎕(-20℃), methanol과 dry ice의 혼합액(-70℃)

실험 방법

1. 실험 과정

1) micro pipet으로 PCR 후의 DNA sample 20㎕를 1.5㎖의 plastic microcentrifuge tube에 넣고, 3M sodium acetate(초산나트륨) 2㎕를 첨가(pH 5.2)한다.

 

2) 그 후 tube에 95% ethanol(-20℃) 50㎕를 첨가한다.(100% ethanol을 첨가해도 상관없다.)

 

3) vortex로 15분 동안 혼합한 후, tube를 methanol과 dry ice로 혼합된 -70℃의 용액에 20분간 담근다. 혼합액은 slurry(현탁액) 상태로 나타난다.

 

4) tube를 microcentrifuge를 사용하여 13,000 rpm으로 20분간 원심분리한다. 그러면 DNA가 침 전된다.

 

5) 아주 조심스럽게 pipet tip을 이용하여 조심스럽게 상층액을 제거한다.(서로 섞이지 않도록 주의한다.)

 

6) 상층액을 제거한 뒤, 70% ethanol(-20℃) 250㎕을 가하여 침전물을 세척한다. 그 후 vortex로 완전히 혼합한다. 이 과정은 DNA를 제외한 다른 용질을 제거하기 위한 것이다.

 

7) 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 조심스럽게 상층액을 제거한다(서로 섞이지 않도록 주 의한다.)

 

8) vacuum desiccator(진공 데시케이터)로 10～15분 정도 진공 건조한다(조심스럽게 진공을 시 킨다). 또는 lyophilizer(냉각건조기)로 1∼2분간 DNA pellet을 건조한다.

 

9) 보관할 때에는 TE buffer(pH 8.0)에 DNA를 녹인다(10mM Tris-HCl at pH 8.0의 0.1 또는 1mM Na2EDTA).

참고 문헌

1. 유전공학개론. Takeshi Uozumi 저, 김재호, 장혜영 역. 靑文閣. 2001, pp38～41.

2. PCR 실험의 원리와 응용. 최용락, 정수열, 이영춘. 세종출판사. 2003, pp111～117.